Обзор

Мутантные вирусы гепатита В: предмет исключительно академического интереса или проблема с далеко идущими последствиями?

Mutant hepatitis B viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications?

Guido Francois a,*, Michael Kew b , Pierre Van Damme a ,

M. Jeffrey Mphahlele c , Andre´ Meheus a

a WHO Collaborating Centre for Pre_ention and Control of Viral Hepatitis, Department of Epidemiology and Social Medicine,

Uni_ersiteit Antwerpen, Uni_ersiteitsplein 1, B- 2610 Antwerpen, Belgium

b Department of Medicine, Molecular Hepatology Research Unit, Medical Research Council, Uni_ersity of the Witwatersrand, 7 York Road,

Parktown, Johannesburg 2193, South Africa

c Department of Virology, Medical Uni_ersity of Southern Africa, PO Box 173, Pretoria 0204, South Africa

 

1.Введение

Выполнение директив ВОЗ по вакцинации является несомненно одним из наиболее эффективных путей профилактики гепатита В в глобальном масштабе. Ассамблея ВОЗ (World Health Assambley) рекомендовала повсеместное включение вакцинации против гепатита В к 1997 году в национальные программы иммунизации детей. Регионам с низким уровнем распространения гепатита В (HBV), включая Европу, предлагалось дополнительно проводить универсальную иммунизацию подростков [1, 2]. Параллельно, к вакцинируемым категориям были отнесены взрослые, принадлежащие к так называемым “группам риска”.

Эффективные вакцины против гепатита В стали доступны в начале восьмидесятых годов. Они содержат высоко иммуногенные поверхностные антигены вируса. Однако, уже описано огромное количество мутаций, затрагивающих многие вирусные белки, что заставляет задаться вопросом: смогут ли современные вакцины столь же эффективно справляться со своей задачей в будущем? Для того, чтобы лучше понять, как связаны мутации с иммунными механизмами “уклонения” или “бегства” с одной стороны и как учитывать этот феномен при создании вакцины и разработке вакцинальных программ - с другой, важно хорошо представлять структуру вируса и его генома, типы антивирусных иммунологических реакций и характеристики современных вакцин.

2. Гепатит В

Гепатит вызывается у человека разнообразными вирусами. Часть из них детально описана, среди них вирусы гепатита А-Е [3], G и TT. Приводящая к воспалению в случае симптоматического течения инфекция обычно вызывает желтуху, лихорадку, общее недомогание, тошноту, потерю аппетита и повышение сывороточного уровня печеночных ферментов – аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ). В определении ВОЗ указано, что клинический случай острого вирусного гепатита – это острое заболевание, которое характеризуется дискретным симптомокомплексом и желтухой или вызывает повышение уровня сывороточных аминотрансфераз (более чем в 2.5 раза по сравнению с верхней границей нормы) [4]. HBV может так же быть причиной хронического гепатита, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы.

Гепатит В вызывается HBV (род Orthohepadnavirus, семейство Hepadnaviridae), преимущественно гепатотропным агентом, и был первоначально назван сывороточным гепатитом [5, 6]. Под гепатотропностью подразумевается проникновение и, в большинстве случаев, существование вируса в гепатоцитах человека. Как результат – некровоспалительное заболевание печени различной степени тяжести, протекающее в разных формах.

Хотя гепатит В вызывается вирусом, сам по себе HBV не обладает прямым цитопатогенным эффектом и вызывает лишь ограниченные повреждения в печени [7]. Вторичный цитопатогенный эффект наблюдается только в случаях затяжного течения инфекции, когда в клетках хозяина можно обнаружить избыточное количество филаментных форм вирусных частиц. Инфицированные гепатоциты, однако, атакуются и разрушаются в ходе защитных иммунологических реакций. Клинический исход всецело зависит от иммунной системы хозяина [8, 10].

В случае хронической инфекции в сыворотке человека содержится три вида частиц [11]. Полные, инфекционные вирионы, первоначально названные “частицами Дейна” [12], имеют размер 42 nm. Оболочка окружает внутреннюю 27 nm сердцевинную частицу, содержащую вирусную ДНК. Неполные компоненты вируса присутствуют в двух формах: сферические дольки диаметром 20 nm встречаются в огромных количествах (их число превышает количество вирионов до миллиона раз) и сопровождаются тубулярными формами различной длины и диаметром 20 nm. Эти сферические и филаментные частицы не содержат ДНК и не обладают инфекционными свойствами [13].

3. Вирусная генетика

Среди вирусов гепатита человека HBV – единственный, содержащий ДНК. Его 3.2 kb геном делает этот мельчайший ДНК вирус инфекционным для человека [14]. Круговая ДНК только частично двуцепочечная и содержит огромное количество одноцепочечных разрывов различных размеров [15]. Эндогенная ДНК-полимеразная активность позволяет вирусу встраивать нуклеотиды, используя матрицу вирусного проихождения, и достраивать незавершенную цепочку [16]. Перед тем, как происходит репликация генома, образуется полнодлинная промежуточная РНК плюс-цепь или прегеном [17]. Следовательно, HBV ДНК геном образуется путем обратной транскрипции прегенома, катализируемой вирусной полимеразой (обратной транскриптазой). В этом отношении HBV демонстрирует черты, присущие ретровирусам [18]. Огромные геномные РНК содержат полную генетическую информацию и выполняют двойную функцию, и в качестве прегенома, и как матрица для трансляции вирусных белков [11].

Заметная экспрессия продуктов вирусных генов и репликация вируса происходит только в печени, хотя эти процессы, на более низком уровне, также протекают и в других типах клеток [19]. Комбинация различных сайтов начала трансляции и четырех перекрывающихся открытых рамок считывания (ОРС) позволяет вирусу продуцировать обширный класс различных белков [20]. ОРС названы S (surface – поверхность), С (core – ядро), Р (polymerase – полимераза) и Х [21]. Кроме этих вирусных генов было идентифицировано большое число генетических элементов с cis-активностью. Они, наряду с выполнением других функций, участвуют в регуляции репликации HBV и инкапсидации транскрипта прегеномной РНК [22], а также высокоуровневой экспрессии продуктов вирусных генов [23].

4. Вирусные белки

Вирион состоит из комплекса белок-нуклеиновая кислота, нуклеокапсида, окруженного мембраноподобной липопротеиновой оболочкой. Среди липидов, составляющие оболочку, - триглицериды, фосфолипиды, а также холестерол, все три вида липидов были выделены у инфицированных людей. Нуклеокапсид имеет форму икосаэдра, образуемую HBcAg, белком ядра, и содержит вирусную ДНК и полимеразу. Оболочка тесно связана с поверхностным антигеном, трансмембранным белком, присутствующим в виде трех родственных форм, кодируемых одной ОРС (S-ОРС) с тремя отдельными сайтами начала трансляции (ATG). Общий стоп-кодон (TAA, охра) позволяет объяснить существование трех различных белков с единым карбокси-окончанием. Они еще не достаточно охарактеризованы и в целом носят название поверхностного антигена гепатита В (HBsAg). HBsAg также ранее назывался гепатитным антигеном, гепатит-ассоциированным антигеном или Австралийским антигеном [24]. Это наиболее удобный маркер HBV, присутствие HBsAg в сыворотке пациента является индикатором острой или хронической HBV инфекции. Антиген определяется в сыворотке за 1-2 месяца до появления каких-либо клинических симптомов. Хроническое носительство подразумевает присутствие HBsAg в сыворотке больного на протяжении более шести месяцев. Некоторые носители спонтанно избавляются от HBsAg, и более не считаются инфицированными [25].

S регион генома подразделяется на S, пре-S1 и пре-S2 области. Малый (S) или главный HBsAg кодируется S геном и состоит из 226 аминокислот. С количественной точки зрения это наиболее важный белок в вирионе, сферической и филаментной частицах. Акроним HBsAg иногда используется для обозначения этого белка. Дисульфидные связи – существенный элемент стабилизации его трехмерной структуры. HBsAg имеет важнейшее значение, так как содержит основные нейтрализующие эпитопы и поэтому используется в коммерческих вакцинах против гепатита В. Присутствие антител только к HBsAg (анти-HBs) уже достаточно для того, чтобы предупредить HBV инфекцию [17, 26]. Средний (M) HBsAg кодируется S геном и пре-S2 областью генома и включает следующие 55 аминокислот. Большой (L) HBsAg кодируется S геном и обеими пре-S2 и пре-S1 областями генома, чем объясняется наличие дополнительных 119 или 108 аминокислот, в зависимости от субтипа (генотипа). Мембрана вириона представляет собой смесь S, M и L белков в гликозилированной и негликозилированной формах [27-29].

Пре-S1 и пре-S2 белки, названные после выяснения локализации соответствующих генов в геноме, - это дополнительные поверхностные антигены, экспрессируемые в гораздо меньшем количестве, чем S протеин [30]. И это несмотря на то, что пре-S1 и пре-S2 белки содержат структуры, необходимые для прикрепления HBV к гепатоцитам. Они также включают большое количество Т и В-клеточных эпитопов [26]. Прикрепление и последующее проникновение вируса в клетки возможно опосредуется рецепторами, принадлежащими к аннексинам, семейству кальций-связывающих белков, взаимодействующих с фосфолипидами мембраны [31].

И сердцевинный белок (HBcAg) и е-протеин (HBeAg), секретируемый белок, являются продуктами пре-core/core (pre-C/C) гена и содержат около 160 общих аминокислот. HBeAg можно считать побочным продуктом синтеза HBcAg, это полипептидный фрагмент последнего, приобретающий свою окончательную форму в результате пост-трансляционного процессинга. HBeAg невозможно обнаружить в составе вирусной частицы, однако он присутствует в сыворотке больных и является маркером высокой вирусной репликации и инфекционности. В сыворотке он определяется в течение ограниченного промежутка времени в случае острой инфекции и у хронических вирусоносителей [25, 32]. HBeAg также экспрессируется на поверхности гепатоцитов [33] и, полагают, что он является важнейшей мишенью, на которую направлены защитные иммунологические реакции, приводящие к разрушению гепатоцитов [34, 35]. HBeAg вызывает иммунологическую толерантность и, таким образом, тесно связан с хроническим течением инфекции [14]. Он также может модулировать репликацию HBV, подавляя инкапсидацию прегеномной РНК в нуклеокапсид [36]. Нуклеокапсидный антиген, HBcAg, можно обнаружить в ядрах инфицированных гепатоцитов или циркулирующим только в частицах Дейна. Хотя HBcAg и HBeAg обладают структурным родством и имеют общие эпитопы, иммунологически они не идентичны.

Помимо структурных и секретируемых белков вирус обладает способностью синтезировать несколько неструктурных протеинов. P ген кодирует вирусную ДНК полимеразу/обратную транскриптазу. Р-ОРС перекрывается со всеми ОРС. Х ген ответственен за экспрессию Х антигена, или HВxAg, белка, чьи биологические и патобиологические функции не до конца понятны. Известно, однако, что продукты Х гена обладают регуляторными свойствами и активируют транскрипцию большого количества клеточных промоторов [10, 37, 38].

 

5. Вакцины

Иммунизация против гепатита В осуществляется путем введения иммуноглобулинов (пассивная иммунизация) или вакцин (активная иммунизация). Пассивная иммунизация основывается на использовании стандартных разведений иммуноглобулинов, направленных против HBsAg (HBIg), полученных от носителей, в плазме которых содержится высокий титр этих антител. HBIg используется до сих пор, он вводится, наряду с проведением вакцинации, неиммунным персонам, находившимся в контакте с зараженной кровью, например, случайный укол иглой, или детям, рожденным HBeAg-позитивными вирусоносительницами. Вакцины первого поколения содержали очищенный и термо-инактивированный, высоко иммуногенный HBsAg и производились на основе плазмы доноров (хроническая HBV инфекция) [39].

Более совершенные вакцины стали производиться путем генетических манипуляций с дрожжами (Saccharomyces cerevisiae) [40] или клетками млекопитающих, например, клетками яичников китайских хомячков (CHO) [41], в которых клонируется HBV S ген. Используемые в настоящее время ДНК рекомбинантные вакцины (YDV) являются продуктом культивируемых дрожжевых клеток и содержат около 95% HBsAg и не более 5% дрожжевых белков. Для стабилизации и консервации добавлены в небольших количествах гидрооксид алюминия и тимерозал, соответственно. Рекомбинантные вакцины не имеют недостатков плазменных вакцин, а именно: относительно высокой себестоимости, ограниченной доступности. Они совершенно безопасны, а клинические реакции на вакцинацию носят умеренный и транзиторный характер. Единственным отличием натурального HBsAg от рекомбинантного является то, что последний не гликозилирован [42-47].

Лицензированные вакцины против гепатита В содержат пустые, субвирусные частицы, включающие HBsAg. HBsAg был выбран для этих целей, так как доминантный нейтрализующий гуморальный ответ направлен именно против этого антигена [26]. Строго говоря, HBsAg - это не только термин, обозначающий HBsAg сам по себе, но и оболочку вируса, которая состоит из белков, углеводов и липидов, помимо собственно поверхностного антигена. Белки синтезируются самим вирусом. Липиды и углеводы, с другой стороны, имеют “хозяйское” происхождение. Этот макромолекулярный комплекс и является наиболее важным компонентом рекомбинантных вакцин. Внутримышечное введение частиц HBsAg приводит к синтезу антител, направленных против HBsAg (анти-HBs), и пролиферации HBsAg-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Экстракция липидной составляющей оказывает заметное воздействие на иммуногенность HBsAg: делипидированный HBsAg лучше распознается Т-клетками, чем нативный HBsAg, но в отношении В-клеток наблюдается прямо противоположный эффект [20, 48, 49].

Будущие вакцины могут включать, помимо HBsAg, другие HBV-специфические белки или аминокислотные последовательности с целью повышения их иммуногенности. Тестируемые последовательности-кандидаты получены на основе пре-S белков, сердцевинного белка или вариантов HBsAg [50, 51]. О них еще будет сказано ниже.

6. Генотипы, серотипы, субтипы и детерминанты

Генотип в общем определяется как генетическая структура организма или клетки. В эволюционном контексте этот термин иногда используется и более специфически, применительно к стабильным формам, в которые, например, вирусы, переходят после целого ряда изменений на протяжении длительного периода времени, что означает, что они охарактеризованы на основе их геномных последовательностей. Если они характеризовались с позиций серологии, то чаще речь идет о субтипах или серотипах. Иногда высказываются предположения, что природа генотипа или субтипа не влияет на клиническое течение HBV инфекции [10, 52]. Однако, это суждение остается спорным.

Для того, чтобы избежать путаницы в терминологии, рекомендуется использовать термины “серотип” и “серологический субтип” как синонимы и не употреблять менее специфического выражения “субтип”. По тем же самым причинам стоит придерживаться классического определения понятия “генотип”, особенно потому, что этот термин применяется к HBV штаммам (E-F), о стабильности которых нет информации [53].

Количество серотипов HBV известно. Существование общей а детерминанты HBsAg и, по крайней мере, двух взаимно исключающих субдетерминант – d или y , и w или r, позволяет говорить о четырех серотипах: adw, ayw, adr и ayr. Они имеют разное географическое распределение и общепризнана их значимость как эпидемиологических маркеров. Традиционно классифицированные серотипы иногда ошибочно называют генотипами. Генетический анализ, однако, показал, что четыре вышеупомянутых серотипа не соответствуют с полной очевидностью единственным генотипам [10, 54]. На сегодняшний день идентифицировано шесть генотипов (A-F) HBV и девять серотипов. А детерминанта имеет особое значение, так как это доминантный эпитопный кластер HBV, с которым происходит связывание большинства анти-HBs, присутствующих в гипериммунной сыворотке. Кроме того, он наиболее консервативный из HBV серотипов, по этим причинам HBsAg является ведущим компонентом современных вакцин [14, 25, 53, 55].

А детерминанта – часть большого гидрофильного региона (major hydrophilic region – MHR) HBsAg и ее третичная структура определяет его антигенные свойства. Первоначально предложенная модель состояла из 23 аминокислот, расположенных между 124 и 147 позицией, образующих две петли, выступающих за внешнюю поверхность вируса [56, 57]. Антитела с более высокой специфичностью, полученные от вакцинированных людей, связываются с регионом, состоящим из девяти аминокислот, расположенных между 139 и 147 позициями. С другой стороны, под а детерминантой понимается структурный кластер эпитопов, протяженностью по крайней мере до 120 положения, так как связывание антитела в области 122 аминокислоты зависит от вариации в 139-147 регионе, в то время как связывание антитела с аминокислотами 139-147, напротив, реагирует на изменение в положении 120-124 аминокислот. В диагностических тестах для выявления HBsAg могут быть использованы специфические антитела, направленные против “удлиненной” а детерминанты [58].

7. Мутанты и варианты: терминология

На языке генетики мутант (от mutare, изменяться) – это ген, хромосома, организм или популяция, отличающиеся от соответствующего дикого типа одной или более мутацией. Мутация, в свою очередь, это относительно постоянное, наследуемое изменение генетического материала, состоящее либо в биохимическом изменении кодона, либо – физическом изменении межхромосомных взаимоотношений. Точечная мутация возникает как результат замены, добавления или делеции нуклеотидов. Может также происходить достраивание или делеция целой последовательности нуклеотидов. Имеют место также мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания (вставка или делеция одного или более оснований, приводящая к сдвигу рамки считывания, используемой для трансляции последовательности), смысловые (missense) мутации (кодон для определенной аминокислоты мутирует в другой, специфичный для другой аминокислоты) и несмысловые (nonsense) мутации (замена основания, приводящая к образованию нонсенс-кодона, в результате чего происходит преждевременное торможение синтеза белка). Мутации могут приводить к синтезу дефектного, неактивного белка или к потере способности продуцировать ранее синтезируемые белки. Термин “мутация” также используется для обозначения индивидуальных черт или особенностей, возникших в результате мутаций, о которых шла речь выше.

Мутации могут возникать спонтанно или в результате действия внешних мутагенов. Некоторые авторы разделяют понятия “мутанты” и “варианты”, первые отражают последовательность изменений под действием внешних влияний, таких как химические реагенты, радиация, температура и иммунологический отбор, вторые относятся к естественно возникшим изменениям [28, 52, 59]. Подобное разделение может приниматься как рабочая гипотеза, возможно, в какой-то мере искусственная. Оно легко может привести к путанице, так как используемое также выражение “генетические вариации” имеет другое значение и обычно употребляется для обозначения фенотипических различий индивидуумов в популяции. Более того, происхождение мутаций часто не известно, что затрудняет выбор определения. В некоторых случаях остается непонятным, возникли “варианты” в результате отбора из предшествующих минорных видов или в результате мутационных изменений под действием, например, иммунологического давления [60]. Наконец, “мутации” – причина возникновения и “мутантов” и “вариантов”, и эта этимологическая двусмысленность только добавляет путаницы. Тоже самое справедливо в отношении таких часто используемых выражений, как “естественно возникшие варианты”, излишне многословного, или очевидно противоречивого - “мутантные генотипы” [14, 55, 59].

Принимая во внимание эти аргументы, термины “мутант” и “вариант” оба могут быть использованы в более широком смысле, т.е. для обозначения всех генетически гетерогенных вирусов, безотносительно природы причинных механизмов. В целом, генетические варианты, сосуществующие в клетке или организме, носят название “квазивиды” [14, 61, 62].

8. Специфические мутанты HBV

 

Отношения хозяин-вирус – это сложный и динамичный взаимообмен, включающий целый ряд аспектов, в том числе патогенез и вирусный мутагенез. Возникновение и/или отбор мутантов отражает попытки вируса противостоять иммунологической атаке хозяина и выжить. Число и распространенность некоторых мутантов HBV в сыворотке больных хроническим активным гепатитом изменяются как функция по времени [63, 64]. Первичные точечные мутации предоставляют существенное преимущество в том случае, если они позволяют вирусу ускользнуть от иммунного ответа хозяина. Последующая эволюция мутаций, однако, показывает, что вторая генерация мутантов отбирается как результат индукции летальных иммунных реакций против первой генерации. В результате, со временем антигенная структура вируса становится все запутанней и сложней. Таким образом, хозяину становится все труднее и труднее “отлавливать” вирус и избавляться от него посредством иммунологических механизмов. В этом отношении, увеличение числа мутаций в случае хронической HBV инфекции на стадии обострения прогрессирующего заболевания печени можно рассматривать как доказательство их адаптивного характера [17, 63].

Мутации HBV были описаны уже неоднократно. HBV гораздо больше подвержен мутагенезу, чем ранее предполагалось, так как во время его репликации происходит обратная транскрипция РНК прегенома, а этот процесс, как известно, не застрахован от ошибок, так как не предусмотрена возможность проверки считывания [27]. Подобная репликация приводит к замене 2х10-4 оснований на сайт в год, т.е. на 4 порядка больше, чем у других ДНК вирусов, но меньше, чем у РНК-содержащих вирусов [65]. Наличие протяженных делеций говорит о том, что действуют также и другие мутагенные механизмы. Возможно “проскальзывание” во время ошибочного объединения пар между матрицей и прогенной ДНК цепью, воздействие клеточных топоизомераз и сплайсинг гена с использованием альтернативных донорных и акцепторных сайтов. Мутации могут также возникать в результате рекомбинаций между ко-инфицирующими штаммами. Мутации HBV не ограничиваются специфическими ОРС и затрагивают все вирусные гены и регуляторные элементы. Мутанты были идентифицированы у пациентов с острым или фульминантным гепатитом, так же как и у больных хронической HBV инфекцией. Их можно сгруппировать следующим образом: мутанты пре-C/C гена, мутанты пре-S/S гена, мутанты гена полимеразы/обратной транскриптазы и мутанты Х гена. Пациенты, у которых мутанты сосуществуют с диким типом вируса, также не исключение. Действительно, многие инфекции, связанные с мутантными вирусами, могут являться смешанными инфекциями такого типа, когда различные ДНК матрицы дополняют друг друга путем транс-активации или рекомбинации ДНК [17, 66].

О существовании мутантов HBV впервые предположили, когда у больных хроническим гепатитом В, у которых выделялась ДНК или РНК HBV, не было обнаружено серологических маркеров активной или перенесенной инфекции, а именно отсутствовал HBsAg или анти-HBs, соответственно. Так как HBV инфекция может персистировать годами и даже десятилетиями, мутации могут накапливаться и становиться клинически выраженными. Фактор времени, высокая репликативная активность вируса (высвобождение в периферическую кровь до 1011 вирусных частиц в день), а также иммунный и терапевтический прессинг в этом отношении играют решающую роль. Помимо того, что определенные мутации ассоциированы со специфическим протеканием инфекции, некоторые мутации могут приводить к серьезным последствиям на различных уровнях, что позволяет классифицировать их в зависимости от вовлеченных механизмов. Снижение вирусного клиренса под действие иммунных механизмов или антивирусной терапии носит название “иммунного бегства” или “терапевтического бегства”, соответственно. Мутации генов оболочки приводят к снижению или полному отсутствию детекции вируса тестами, базирующимися на использовании антител к дикому типу вируса (“диагностическое бегство”) или не распознаванию нейтрализующими антителами, индуцированными вакцинацией (“вакцинное бегство”) [62, 67, 68].

9. Мутанты пре-core и core гена

Наиболее часто наблюдаемая пре-core мутация – это трансверсия G на А в 1896 нуклеотиде. Эта замена приводит к появлению трансляционного стоп-кодона (TAG) в дистальном участке пре-core гена и нарушению экспрессии пре-C/C протеина, который функционирует как предшественник HBeAg [69]. Менее распространенные пре-core мутации, приводящие к HBeAg-негативности, включают: мутации инициирующего кодона (в позициях 1814 или 1815), nonsensе мутацию в положении 1874, missensе мутацию в положении 1862 и сдвиги ОРС [70]. В сыворотке пациентов, инфицированных подобными мутантами, не содержится HBeAg, а гепатоциты, пораженные мутантным вирусом, не экспрессируют HBeAg на своей поверхности. В связи с тем, что HBeAg – важная иммунологическая мишень, эти клетки не подвергаются киллингу, опосредованному иммунной системой хозяина. На ранних стадиях хронической HBV инфекции, когда в сыворотке можно обнаружить HBeAg, дикий тип вируса выживает. На более поздних стадиях, однако, популяция вируса уменьшается в количестве и, возможно, в результате продолжительного взаимодействия с иммунной системой хозяина, происходят мутации, приводящие к нарушению экспрессии HBeAg. HBeAg-негативные мутанты получают преимущество, становятся доминантным типом и способствуют продолжению инфекции.

Мутации 1896 стоп-кодона часто встречаются у пациентов с хроническим активным или неактивным гепатитом и у асимптоматических вирусоносителей в странах Средиземноморья и Востока [71-75]. Напротив, эти мутанты редко встречаются в Северной Америке, Восточной Европе и Южной Африке [76-78]. Такое географической распределение связано с распределением HBV генотипов. В тех регионах, где доминирует генотип А, 1896 мутант встречается редко. В проксимальном стволе РНК инкапсидационного сигнала или эпсилон (e ), G остаток в 1896 положении в норме образует пару с T(U) в 1858 положении не-А- генотипов, и с С в А-генотипе [79]. Переключение G на А в 1896 позиции приводит к нестабильному парообразованию (А-С) в этой позиции, дестабилизации структуры ствол-петля e и снижению эффективности репликации HBV [70, 80-82]. Напротив, в не-А генотипах эта мутация способствует образованию Уотсон-Криковской пары оснований Т(U)-А, стабилизирующей вторичную структуру e и усиливающей вирусную репликацию. Мутация 1899, которая может быть связана с 1896 мутацией, или какой-либо другой, также приводит к HBeAg-негативности, это еще одна мутация, повышающая стабильность e за счет дополнительной А-Т(U) пары оснований [70, 83].

Мутация стоп-кодона 1896 часто встречается у пациентов с фульминантным гепатитом В, что первоначально навело на мысль о возможном влиянии на течение заболевания мутантного вируса [14, 66, 84-86]. Этот мутант, однако, не всегда выделяется у пациентов с фульминантным гепатитом В [87, 88] и может также вызывать самоограничивающийся острый гепатит В [89], что говорит о том, что мутант сам по себе не является детерминантой фульминантного гепатита.

Мутация в положении 1862 была выявлена у асимптоматических HBV носителей и у пациентов с хроническим гепатитом, циррозом, гепатоцеллюлярной карциномой и фульминантным гепатитом [70, 90]. Эта мутация воздействует на экспрессию HBeAg на двух уровнях. Она происходит рядом с сайтом гидролиза сигнального пептида, где сигнальный пептид отделяется от предшественника HBeAg в эндоплазматическом ретикулуме, и, может таким образом, аннулировать синтез HBeAg. С другой стороны, эта мутация может влиять на обратную транскрипцию прегеномной РНК. Полимераза (обратная транскриптаза) действует как праймер ДНК-синтеза путем связывания с выступом e . И, хотя присоединение матрицы в положении 1862 играет не столь решающую роль, как связывание с 1864 и 1865 позициями, 1862 мутация, вероятно, может снижать эффективность обратной транскрипции. Инкапсидация и репликация HBV также может нарушаться под действием мутаций в верхней части ствола и петле e [79].

Core ген содержит и гуморальные и цитотоксические Т-клеточные эпитопы [91]. Мутации в области иммунодоминантных цитотоксических Т-клеточных эпитопов помогают вирусу укрыться от защитных иммунологических реакций, играющих решающую роль в клиренсе вируса. Делеции core гена были описаны у иммунокомпромитированных пациентов и азиатов с хроническим гепатитом В или гепатоцеллюлярной карциномой [92, 93]. Эти делеции почти всегда связаны с потерей В и Т-клеточных эпитопов и могут предоставлять вирусу селективное преимущество. Множественные точечные мутации core гена обнаружены у пациентов с хроническим гепатитом В в странах Азии и Средиземноморья [94-97]. Несмотря на то, что они могут быть сосредоточены в сайтах основных В- и Т-клеточных эпитопов, остается неясным, насколько часто функции эпитопов цитотоксических Т-клеток при этом непоправимо нарушаются. Точечные мутации core гена редко встречаются у больных в Америке или белых британцев с хроническим гепатитом В [98], что говорит о том, что, в целом, хронизация заболевания не связана с этими мутациями. Тем не менее, у двух пациентов, хронически инфицированных HBV, были обнаружены мутантные эпитопы, которые действовали как естественные антагонисты Т-клеточных рецепторов, участвующих в распознавании антигена, и подавляли ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, направленный против эпитопов дикого типа вируса [68, 99]. Таким образом, они могли способствовать персистенции вируса.

10. Мутанты пре-S и S гена

Точечные замены в S гене представляют собой особый интерес, так как они влияют на иммуногенность HBsAg, особенно а детерминанты (против которой вырабатываются нейтрализующие антитела). Для того, чтобы объяснить последствия мутаций в одном регионе (и локальных и линейно удаленных эпитопах) первоначальная двух-петлевая модель а детерминанты (124-147 позиции) [56] с дисульфидными связями между аминокислотами 124 и 137, недавно уступила место цистеиновой модели MHR (100-160 или 169 позиции) S протеина [59]. В настоящей модели также учтены возможные дисульфидные связи, но, кроме того, дополнительно предполагается наличие в переплетенной структуре цистеина в положениях 107, 137, 138, 139 и 149. Две петли (107-137 и 139-147) выступают за внешнюю поверхность вириона и, возможно, связаны, кроме того существует еще одна компактная петля между 121 и 124 аминокислотами. В целом, MHR разделен на пять антигенных областей, названных HBs1 (до 120 позиции), HBs2 (120-123), HBs3 (124-137), HBs4 (139-147) и HBsS (148-169). Существуют свидетельства того, что петли, образованные HBs2 и HBs4, соответственно, пространственно близки [28].

Поиск мутантов S гена начался после того, как появились сообщения о пациентах, либо HBsAg-негативных/анти-HBc и/или анти-HBs-позитивных, либо не имеющих маркеров HBV инфекции и содержащих HBV ДНК в сыворотке. На сегодня зарегистрировано огромное количество мутантов, которые не распознаются коммерческими HBsAg-тестами. Повышенный интерес к мутантам S гена появился после идентификации мутантов “вакцинного бегства” у детей, рожденных HBeAg-позитивными женщинами, заболевших гепатитом В несмотря на полный курс пассивно-активной иммунопрофилактики [56]. HBsAg и анти-HBs циркулировали у этих детей одновременно. Прототипом и наиболее часто встречаемой мутацией такого типа является замена глицина на аргинин в 145 положении HBs4 региона, вызванная заменой гуанозина на аденозин в положении 587 нуклеотида [56]. Этот мутант был обнаружен при проведении исследований в Сингапуре, Италии, Японии, Тайване, Индонезии и Брунее [100-103]. G145R стабилен, так как персистенция тех же самых мутантов у детей продолжалась на протяжении по меньшей мере 14 лет [104]. Мутации кодонов 123, 124, 126, 129, 133, 142 и 144 могут происходить сами по себе или в комбинации [65, 105]. В США при обследовании детей, рожденных HBV-носительницами, было обнаружено значительное количество случаев приобретенной хронической инфекции несмотря на пассивно-активную иммунизацию. У 23% инфицированных детей была обнаружена замена одной или более аминокислот а детерминанты, чаще всего в положении 142-145 [106]. Доказано, что G145R жизнеспособен, обладает инфекционными и патогенными свойствами (у шимпанзе) [107].

Другие типы вакцин-ассоциированных мутантов были обнаружены у вакцинированных в других странах, например, missense мутант T/I126N – в Японии, KI41E - в Гамбии [109]. Выявляемость HBsAg, включающего KI41E, с помощью анти-HBs моноклональных антител и коммерческих ELISA, снижена по сравнению с нативным протеином [28].

Трансплантация печени, показанная при хроническом заболевании этого органа, вызванном HBV инфекцией, связана с существенным риском ре-инфекции трансплантанта, развития печеночной недостаточности и гибели больного. Когда для предупреждения реинфекции донорского органа после трансплантации вводится HBIg, создаются оптимальные условия дли индукции мутаций. Мутанты возникают в присутствии высоких титров антител, небольшого количества вирусов и большого числа неинфицированных гепатоцитов. Иммунный прессинг, оказываемый и моноклональными антителами и HBIg, приводит к селекции “мутантов бегства” [110, 111]. Происходят делеции и вставки. Мутации чаще всего наблюдаются в MHR области, окружающей 145 кодон, и включают точечную мутацию G145R, которая также часто встречается у HBsAg-вакцинированных людей [112].

Возникает вопрос: появляются ли все мутанты этого типа de novo или они происходят из пула предсуществующих вариантов, получающих селективное преимущество перед диким типом [60, 113]? Было показано присутствие G145R в природных изолятах [27], его выявляемость с помощью целого ряда диагностических тестов чрезвычайно низка, особенно в контексте y субтипа [59]. Анализ случайно отобранных образцов 2001 HBV-вирусоносителя без каких-либо симптомов заболевания в районе Сингапура, проведенный в 1990-1992 годах, выявил присутствие HBsAg-мутантов по крайней мере у 0.8% участников исследования [114, 115]. Способность и поликлональных и моноклональных HBsAg-тестов обнаруживать HBV мутантов в виремической сыворотке из Папуа Новой Гвинеи, Южной Африки и Сардинии исследовалась путем использования комбинаций этих тестов. В целом, было идентифицировано 16 новых мутантов и два новых потенциальных эпитопных кластера. Ни одно из обнаруженных изменений не затрагивало эпитопный кластер (139-147 аминокислоты) а детерминанты, которая регулярно подвергается мутациям после проведения вакцинации против гепатита В или введения HBIg. Это значит, что обнаруженные варианты, возможно, не являются “мутантами бегства от нейтрализации”, а относятся к естественным вариантам. Тем не менее, если они могут избегать нейтрализации анти-HBs, значит они могут инфицировать вакцинированных людей и распространение их будет увеличиваться по мере того, как будет расти охват населения вакцинацией. Еще один вывод, который следует из этого исследования, состоит в том, что основной эпитопный кластер HBsAg не ограничивается а детерминантой, а охватывает практически весь MHR [58].

Исследования, проведенные в различных частях света, продемонстрировали существование и других мутантов “диагностического бегства”, что приводило к диагностическим ошибкам и ошибкам в определении субтипа вируса [102, 106]. Эти данные означают: во-первых, что разрабатываемые HBsAg-тесты должны быть адаптированы с учетом местных вариантов последовательностей, и, во-вторых, в связи с тем, что не все потерянные результаты можно объяснить наличием вариантов, основным требованием к диагностическим тестам должна являться их высокая чувствительность [28].

Пре-S1 и пре-S2 регионы, наряду с областью 100-160 (169) аминокислоты HBs протеина, представлены на поверхности HBV частиц, высоко иммуногенны и являются потенциальными мишенями для селективного отбора со стороны иммунной системы [65]. Были обнаружены мутации и в пре-S области, включая делеции, доходящие до половины целого пре-S1 региона [117], делецию пре-S2 трансляционного стоп-кодона, других кодонов, полностью прекращающих экспрессию пре-S2 белка [118], делецию 183 нуклеотида рамки считывания [119], многочисленные точечные мутации и серии небольших делеций и вставок [120]. Некоторые делеции не только уничтожают регион пре-S2 промотора, но и сайты, которые распознаются В- и Т-клетками. Напротив, сайты связывания с гепатоцитами, расположенные в пре-S1 области, остаются неизменными. Делеции такого типа потенциально приводят к нарушению клиренса вируса при сохранении его способности прикрепляться к гепатоцитам с последующим проникновением внутрь клетки и, таким образом, могут способствовать развитию хронической HBV инфекции. Кроме того, некоторые их этих мутантов могут получать селективное преимущество в условиях, когда иммунологические реакции направлены на уничтожение дикого типа HBsAg. Однако, было высказано предположение, что если включить в будущие вакцины пре-S детерминанты, это приведет к появлению пре-S делеции и “мутантов бегства” у вакцинируемых [17].

Некоторые мутации в S и пре-S регионах, очевидно, связаны с развитием гепатоцеллюлярной карциномы [121]. Транскрипционная транс-активаторная функция, не представленная в интактном HBV гене, индуцируется мутацией в пре-S/S последовательности, 3’ усеченной во время или после интеграции. Образовавшиеся полипептиды могут сыграть определенную роль в гепатокарциногенезе [122].

11. Мутанты гена полимеразы

Мутации гена полимеразы могут быть связаны с формированием резистентности к терапии аналогами нуклеозидов и персистенцией вируса [123]. Ламивудин (2’,3-dideoxy-3’-thiacytidine) – потенциальный ингибитор РНК-зависимой ДНК полимеразы HBV, необратимо блокирующий обратную транскрипцию и подавляющий репликацию вируса. Таким образом, этот препарат эффективно снижает вирусную нагрузку у хронических HBV носителей. Продолжительная терапия ламивудином, однако, может привести к формированию резистентности в результате появления мутаций, которые разрушают YMDD (тирозин, метионин, аспартат, аспартат) локус в С домене гена полимеразы [124, 125]. Мутации приводят либо к замене метионина на валин (M552V), либо метионина на изолейцин (M552I). Обе замены происходят в 195 и 196 кодонах, перекрывающихся с S-геном. Эффективность репликации YMDD мутантов ниже по сравнению с вирусом дикого типа и, после прекращения приема препарата, дикий вирус вновь “догоняет” мутанта. Ламивудин-резистентные вирусы остаются патогенными.

Фамцикловир – предшественник пенцикловира, ациклического аналога деоксигуанозина. Пенцикловир ингибирует ДНК-зависимую, также как и РНК-зависимую полимеразную активность. Терапевтический эффект сходен с действием ламивудина. В ответ на применение фамцикловира возникают мутации, обычно затрагивающие В домен гена полимеразы. Однако, мутанты, резистентные к действию фамцикловира, явление менее распространенное, чем индуцированные ламивудином [127]. Имеющиеся на сегодня данные позволяют предположить, что YMDD локус остается незатронутым. Наиболее часто встречаемые мутации – L528M и V521L. Еще одна индуцированная фамцикловиром мутация, V551I, происходит в C домене и вызывает преждевременную терминацию перекрывающегося белка оболочки. Описана M539V мутация гена полимеразы, которая стала причиной формирования у пациента резистентности к ряду цитозиновых аналогов, таких как ламивудин, FTC и ddC, а также тимидинового аналога – AZT [128]. Появление популяции вируса с мультилекарственной резистентностью у реципиента печеночного трансплантанта было спровоцировано проведением иммунопрофилактических мероприятий и антивирусной терапии, вызвавшими мутации гена полимеразы [129]. Тем не менее, вирусы, резистентные к фамцикловиру или ламивудину, могут оставаться чувствительными к новым нуклеозидным аналогам, таким как адефовир и лобукавир.

Имеются сообщения и о мутациях гена полимеразы, которые могут быть связаны с вирусной персистенцией [130]. Дисфункция полимеразы, выражающаяся в неспособности к упаковке прегеномной РНК в ядерные частицы, является результатом missensе мутации в 5’ регионе этого гена. Транс-комплементация in vitro полным геном полимеразы дикого типа приводит к восстановлению репликативной способности мутанта.

12. Мутации Х гена

Белок Х гена принимает участие в многочисленных процессах, в том числе внутриклеточной передаче сигнала, транскрипции генов, клеточной пролиферации, репарации ДНК и апоптозе [131-133]. Его разнородная транс-активирующая активность - одна из наиболее полно исследованных функций этого протеина. HBx активирует огромное количество вирусных и множество клеточных генов. Его транс-активационная деятельность осуществляется посредством активации факторов транскрипции, модуляции сигнальных путей в клетке, стабилизации РНК и нарушения нуклеоцитоплазматической транслокации. HBx может играть определенную роль в персистенции HBV инфекции и развитии гепатоцеллюлярной карциномы [133-135].

Описано большое количество делеций Х гена, возможно ассоциированных с вариантами точечных мутаций. Делеция восьмого нуклеотида на 3’ конце гена и в регионе ядерного промотора/усилителя II (CP/ENII) (1770-1777 позиции) [136-138] и делеция 20 нуклеотида в 1752-1772 [139] были описаны у HBsAg и HBeAg – негативных пациентов. Эти делеции, как было показано, снижают активность пре-С промотора, что может быть причиной подавления секреции HBV белков. Делеции в DR1 были обнаружены у больных талассемией, НВ вакцинированных, находящихся на почечном диализе [64, 67]. Отсутствие обычных серологических маркеров HBV - характерная особенность подобных делеций или сопутствующих мутаций в перекрывающемся CP/ENII регионе, В-клеточных эпитопах, DR2 или регионе, кодирующем транс-активирующий Х протеин. Замена Т на С в 5’ конце DR2 была обнаружена у двух HBsAg серонегативных пациентов в Японии [137]. У этих больных также произошла делеция восьмой пары оснований в основном ядерном промоторе, поэтому трудно установить истинную причину отсутствия экспрессии HBsAg. HBV мутант с объединенной Х-С-ОРС, в связи со вставкой единственного нуклеотида в перекрывающемся регионе, был идентифицирован в клеточной линии человеческой гепатомы [140].

13. Мутации ядерного промотора

Ядерный промотор играет центральную роль в репликации HBV и морфогенезе, управляя транскрипцией и прегеномной РНК и pre-core мРНК. Он перекрывается с 3’ концом Х гена и 5’ концом пре-C/C гена. Ряд вариаций в ядерном промоторе ограничен в связи с его центральной ролью в вирусной репликации. Двойная мутация, трансверсия А на Т в 1762 положении и транзиция G в А – в 1764, часто встречается у пациентов с хроническим гепатитом и реже - у асимптоматических носителей, иммуносупрессированных пациентов и у носителей без серологических маркеров HBV [141]. Мутации сопровождаются падением уровня экспрессии HBeAg в связи со снижением связывания печеночного обогащенного фактора и преобразованием сайта связывания ядерного фактора в сайт связывания ядерного фактора гепатоцита 1. Действие, которое оказывает эта двойная мутация на вирусную репликацию, до конца не понятно. Мутация в 1653 положении ядерной обратной регуляторной последовательности (CURS) часто встречается у пациентов с фульминантным гепатитом [142], а в 1753-1757 – у пациентов с фульминантным гепатитом или гепатоцеллюлярной карциномой [143], в обоих случаях в сочетании с двойной мутацией. Большое количество делеций в ядерном промоторе было описано в основном у пациентов с хроническим гепатитом, гепатоцеллюлярной карциномой, асимптоматических носителей и больных HBV инфекцией без серологических маркеров. Большинство делеций приводит к сдвигу рамки считывания и усечению Х протеина на его С-окончании, что оказывает существенное влияние на его транс-активирующую функцию [141].

14. Мутанты бегства: реальная угроза?

Существование мутантов HBV представляет собой не только интерес для исследователей. Верно обратное: мутанты имеют важнейшее значение во многих отношениях. Их возникновение отражает попытки вируса избежать представляющих угрозу для его существования и выживания во враждебной среде механизмов. Последствия чего и для вируса и для организма хозяина непредсказуемы. Совокупность вариантов составляет запас биологического разнообразия вируса, который используется последним в зависимости от обстоятельств. Существуют естественно возникшие варианты, в то же время другие могут возникать под действием иммунных механизмов хозяина, препятствующих инвазии вируса, или антител, образовавшихся в результате вакцинации специфическими антиген-содержащими вакцинами или непосредственно введенных в форме моноклональной или поликлональной иммунотерапии.

Мутанты играют важнейшую роль в истории существования гепатита В и есть основания полагать, что генетические вариации поддерживают HBV инфекцию [17]. Мутанты не до конца еще понятным способом связаны с эволюционным переходом к хронической форме заболевания и, возможно, имеют немаловажное значение в гепатокарциногенезе, развитии фульминантного гепатита и асимтоматическом течении HBV инфекции. Клиническое значение вариантов поверхностного антигена HBV было темой целого ряда обзоров [28, 62, 68, 144, 145]. На диагностическом уровне становится все более очевидно, что мутации HBV генома могут приводить к развитию инфекции с атипичной серологией [146].

Заражение вирусом провоцирует целый комплекс ответных иммунологических реакций хозяина. Врожденные иммунологические механизмы включают активацию фагоцитов, натуральных киллеров и системы комплемента. В адаптивном иммунном ответе принимают участие В-лимфоциты, продуцирующие антитела, Т-хелперные клетки (CD4+ лимфоциты), цитотоксические Т-клетки (CD8+ лимфоциты) и антиген-представляющие клетки (АПК), включая макрофаги и дендритные клетки. Антитела связываются с вирусными белками, в том числе белками оболочки, и способны элиминировать циркулирующие вирусные частицы. CD4+ Т-клетки распознают вирусные антигены, представленные в комплексе с молекулами MHC II класса на поверхности АПК, пролиферируют и продуцируют цитокины, стимулирующие клеточный и гуморальный антивирусный иммунный ответ. CD8+ Т-клетки распознают вирусные антигены, связанные с молекулами MHC I класса, и либо лизируют АПК, либо вырабатывают цитокины [147].

Разрешение острой инфекции связано с мощным, поликлональным, мультиспецифическим ответом CD4+ Т-клеток на антигены нуклеокапсида и CD8+ Т-клеток – на антигены оболочки, нуклеокапсида и полимеразы. У пациентов с хроническим гепатитом В произошел сбой в иммунной обороне. Неэффективность иммунологических реакций, направленных против инфицированных гепатоцитов, может быть связана с несовершенством функционирования иммунной системы или успешной вирусной стратегией, например, образованием мутантов, позволившей избежать иммунологической атаки. Вирус не представляет непосредственной угрозы для хозяина, так как он, в большинстве случаев, не обладает цитопатическим действием. Кроме того, неадекватный иммунный ответ против HBV антигенов, экспрессируемых на поверхности гепатоцитов, только в условиях длительно протекающего заболевания представляет потенциальную угрозу. Хроническая HBV инфекция - это состояние динамического равновесия, поддерживающего существование обоих, хозяина и вируса [148]. Таким образом, из всех клинических вариантов HBV инфекции, хронизация предоставляет вирусу наилучшие шансы.

Самым плохим развитием событий для вируса является сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ, приводящий к элиминации вируса, или смерть больного от последствий заболевания. В ходе острой инфекции специфические антитела, индуцированные HBsAg, быстро образуют комплексы с вирусными частицами, выводят их из циркуляции и предотвращают прикрепление и проникновение в клетки-мишени. Образование специфических антител – процесс, регулируемый Т-клетками. Как было показано, HBV варианты, возникшие в результате мутаций в пре-S/S регионе, способны избежать атаки антител. Кроме того, точечные мутации, удаленные от известных антигенных детерминант, могут вызывать конформационные изменения специфических эпитопов, что делает невозможным распознавание их антителами, как это было продемонстрировано для других вирусов [147, 149].

“Иммунологическое бегство” не ограничивается бегством от антител. HBV, вызывающий хроническую инфекцию, должен также уклоняться от Т-клеточного ответа, приводящего к клиренсу вируса. Уже описано огромное количество возможных механизмов этого вида “иммунологического бегства”. Одним из мест изоляции вируса являются почки или поджелудочная железа, органы с микроваскулярными барьерами, которые предохраняют клетки-мишени от атаки HBsAg-специфических CTL. Точно также мозг, структуры глаз и яички являются иммунологически недосягаемыми тканями с ограниченным доступом для Т-лимфоцитов. В обоих случаях, инфицированные ткани такого типа представляют собой потенциальный резервуар для вируса. Более того, плотность печеночной паренхимы также является фактором, ограничивающим доступ Т-клеток к HBV-инфицированным гепатоцитам, тем самым препятствуя эффективному иммунному ответу [147, 150]. Специфические мутации Т-хелперных эпитопов ядерного белка HBV могут нарушать или даже препятствовать распознаванию Т-клетками и, таким образом, аннулировать Т-клеточную активацию [151]. Тем же образом, мутации антагониста Т-клеточного рецептора CTL эпитопов могут вносить свой вклад в формирование вирусной персистенции [99]. Существуют и другие способы “спрятать” вирус и сделать его невидимым для гуморальных и клеточных защитных реакций. Деятельность обратной транскриптазы позволяет встраивать HBV геном в ДНК клетки-хозяина, делая его недоступным для иммунной системы [25]. Мутации пре-С/C генов, приводящие к появлению HBeAg-негативного HBV [74], также должны квалифицироваться как мутации “иммунологического бегства”, так как инфицированные гепатоциты, не экспрессирующие HBeAg на своей поверхности, более не “рассматриваются” как мишени.

В вакцинированном организме также создаются угрожающие существованию вируса условия. Пост-вакцинальные анти-HBs в целом способны быстро и эффективно пресечь вирусную инвазию. Это , однако, не относится к ситуации, когда образуются мутанты (“мутанты вакцинного бегства”), которые не распознаются этими антителами.

Первичный антигенный стимул (ПАС) или клональный импринтинг могут способствовать появлению и выживанию вариантов HBV. Общая идея состоит в асимметричном характере кроссреактивности защитных антител, обусловленном ранее встреченными вирусными штаммами. Этот феномен первоначально был описан в отношении вируса гриппа [152, 153], а позднее, было доказано, что он также имеет место в случае иммунного ответа, индуцированного другими вирусами, включая HBV [154] и ВИЧ [155], бактериями, такими как Chlamydia trachomatis [156], и простейшими, например Plasmodium falciparum [157]. Оказалось, что принцип, разработанный для гуморального иммунного ответа, применим к некоторым реакциям CTL, по крайней мере в экспериментальных условиях. ПАС приводит к более эффективному клиренсу организмов дикого типа, сосуществующих с девиантными типами у одного и того же индивидуума, что составляет дополнительный механизм, предоставляющий преимущество в плане “иммунного бегства” вновь возникшим вариантам. Это явление легко может быть интерпретировано таким образом: быстро эволюционирующий вирус “прощупывает” пределы нормальных адаптационных возможностей иммунной системы хозяина, предоставляя мутантам возможность неограниченного размножения. Описанный феномен может значительно сказываться на эффективности антивирусных вакцин, особенно если они содержат один иммунодоминантный эпитоп, и должен учитываться при создании новых вакцинных препаратов [154].

Выживание мутантов HBV, появившихся в течение хронической инфекции, может зависеть от наличия многочисленных матриц. Некоторые мутанты способны к самостоятельной репликации, в то время как другие нуждаются для размножения в транс-активационных и рекомбинационных механизмах. Эта ситуация, возможно, является нормой, иначе трудно объяснить такой феномен, как спонтанная реактивация или развитие гепатита В в отсутствии каких-либо очевидных факторов риска [17]. Функциональное сосуществование такого типа [66] и генетическая “поддержка” дикого типа могут быть необходимы в случаях, например, когда в гене полимеразы появляется стоп-кодон [158] или когда делеции затрагивают ядерный белок HBV [159]. Транс-комплементация S, C и Р генов, эписомальная или интегрированная, была продемонстрирована в HBV-инфицированной гепатомной клеточной линии [160]. HBV мутанты, имеющие протяженные делеции в пре-S1 регионе (до половины целого региона), были обнаружены у хронически инфицированных больных, также было показано, что они продуцируют HBsAg на очень низком уровне в результате предполагаемой потери сайтов связывания фактора транскрипции. Эти мутанты сосуществали с диким типом. Делеции не повлияли на функцию гена полимеразы, таким образом, мутантный вирус сохранял способность к репликации. In vitro, однако, секреция инкапсидированного мутантного генома блокировалась и была восстановлена путем ко-трансфекции плазмид, экспрессирующих только пре-S1, пре-S2 и S белки. Было высказано предположение, что in vivo также произошла транс-комплементация [117]. Позднее новый HBsAg мутант был описан у пациентов с хроническим активным гепатитом В при наличии анти-HBs. У большей части вирусов в популяции была обнаружена делеция 31 нуклеотида, приводящая к сдвигу ОРС и появлению стоп-кодона после 21 аминокислоты HBsAg. В результате поверхностный протеин лишался основных нейтрализационных эпитопов, что позволяло вирусу размножаться в присутствии анти-HBs. Полимеразная ОРС была серьезно повреждена делецией и для того, чтобы обеспечить непрерывное образования вирусных частиц, требовалась транс-активация меньшинством интактных геномов [161]. Очевидно, что подобные механизмы способствуют продлению существования таких мутантов.

Новые вакцин-ассоциированные HBsAg мутанты с missense мутациями в регионах вне а детерминанты были обнаружены у иммунизированных детей, рожденных HBV-вирусоносительницами [162]. Мутации состояли в замене аминокислот в позициях 116, 118, 120, 159, 183 и 184. Для некоторых из них было показано снижение связывания с а-специфическими моноклональными антителами. Что это значит, в смысле приспособительной стратегии вируса, еще предстоит выяснить.

Большое число HBsAg мутантов, избегающих нейтрализации антителами, способно реплицироваться независимо. Некоторые из них обладают инфекционными свойствами [107]. Имеют место как вертикальная, так и горизонтальная трансмиссии, приводящие к развитию и острого и хронического гепатитов [103]. Дети, участвующие в исследовании, проведенном в Сингапуре в 1983 году (из 345 детей 41 HBV-позитивных и 16 носителей мутантных вирусов), продолжали оставаться под наблюдением [105]. Их матери были HBsAg и HBeAg-позитивными вирусоносительницами, и дети были иммунизированы HBIg и вакцинированы плазменной НВ вакциной. При проведении анализа через 13 лет после обнаружения мутантов у детей-вирусоносителей было сделано немало важных наблюдений [115]. Во-первых, мутации “вакцинного бегства”, расположенные в а-детерминанте, в основном во второй петле, в том числе и G145R, стабильны. Во-вторых, было доказано, что сосуществование сывороточного HBsAg и анти-HBs является индикатором присутствия HBsAg мутантов. В-третьих, HBsAg мутанты “вакцинного бегства” чаще всего существуют в виде составной части вирусных квази-видов. Их сосуществование с диким типом и другими мутантами наблюдается очень часто. В-четвертых, при попытке классифицировать HBsAg мутантов “вакцинного бегства” на основании предполагаемого нарушения их антигенности, анализируемого компьютером, были выделены две категории. К мутациям первой категории были преимущественно отнесены устойчивые замены в первой петле а (аминокислота 124-137), которые, как было предположено, сохраняют способность связывать нейтрализующие антитела. Мутации второй категории происходят во второй петле (аминокислоты 139-147) и вызывают радикальные изменения, делающие невозможной нейтрализацию антителами. В-пятых, была подтверждена возможность передачи мутантного HBsAg как горизонтальным, так и вертикальным путем. В-шестых, результаты настоящего исследования [115] сравнивались с результатами систематического анализа распространенности HBsAg мутантов у хронических HBV-носителей в случайной популяции в Сингапуре [114, 163]. Были идентифицированы одинаковые мутанты, что говорит о том, что появившиеся вслед за вакцинацией варианты способны к размножению. В-седьмых, существуют HBsAg варианты “вакцинного бегства”, у которых произошли мутации в малом С-терминальном регионе HBsAg, расположенном вне MHR (аминокислоты 175-184), соответствующем одному из эпитопов цитотоксических Т-клеток, рестриктированных по I классу MHC [164]. В–восьмых, предварительная оценка эффективности антивирусной терапии на основе определения уровня HBV ДНК в сыворотке показала, что с G145R не так легко справиться как с диким типом.

HBV мутанты, способные избегать нейтрализации антителами, могут присутствовать в организме носителя в виде минорного компонента вирусной популяции, поэтому их трудно обнаружить, даже после амплификации в ПЦР. Что было продемонстрировано неоднократно при передаче HBV от матери-вирусоносительницы ребенку [56, 165]. Рожденные дети были вакцинированы и иммунизированы HBIg. ДНК HBV была экстрагирована из сыворотки, полученной от матери во время родов, амплифицирована и секвенирована, однако, мутантов HBsAg обнаружено не было. Напротив, у детей на протяжении нескольких лет в сыворотке присутствовал G145R (“мутант бегства”). Несмотря на то, что эта мутация не была обнаружена в материнской вирусной популяции, мутантная последовательность напоминала последовательность вируса, инфицировавшего детей, что говорит в пользу гипотезы о материнском происхождении инфекции. Было высказано предположение, что мутантный вирус, составляющий меньшинство, избежал нейтрализации, в то время как дикий тип подвергся элиминации, и стал доминирующим вариантом у новорожденных детей [166]. В подобных же случаях, о которых появились сообщения позднее, мутанты “вакцинного бегства” с соответствующимим missensе мутациями в кодонах 120, 126 и 134 были обнаружены у вакцинированных инфицированных детей. Мутантные последовательности не удалось получить из материнской сыворотки путем ПЦР клонирования, однако их выборочно размножили, используя амплификационную рефракторную систему для выявления мутаций [167]. И опять было показано, что “мутанты бегства” предсуществовали в материнском организме в качестве минорного варианта [168].

Принимая во внимание все возможные ситуации и механизмы, шансы мутанта на то, чтобы успешно сопротивляться факторам внешнего окружения и быть преданным новому хозяину, довольно высоки. Это утверждение верно, если характеризовать ситуацию с точки зрения естественного отбора. Однако, представляет ли она реальную опасность, к примеру, в плане эффективности использования вакцин против гепатита В в проводимых программах иммунизации? Нет сомнений, что современное поколение коммерчески доступных вакцин на основе HBsAg в подавляющем большинстве случаев эффективно предотвращает заболевание HBV, на сегодня гораздо превосходя риск, связанный с появлением мутантов бегства. Однако, сохранится ли такое положение вещей и в будущем? Большинство авторов рассуждают на эту тему с осторожностью, так как в настоящее время, несмотря на то, что информация о “мутантах бегства” быстро накапливается, имеющихся данных все еще не достаточно для того, чтобы прогнозировать их будущее значение в конкретных цифрах. Что касается других вирусов (HAV, HCV, herpes simplex virus, poliovirus, HIV), то они также демонстрируют значительное генетическое разнообразие и образуют мутантов, отбираемых под действием нейтрализующих антител [17], что делает весьма правдоподобной мысль о том, что, когда вакцинальные программы станут проводиться повсеместно, частота появления “мутантов бегства” еще более возрастет. В любом случае, список различных типов HBV мутантов будет становиться все длиннее и длиннее. По крайней мере теоретически, нельзя исключать, что нарастающее давление отбора будет способствовать тому, что варианты догонят дикий тип и даже достигнут сравнимого уровня распространения [169]. Это утверждение, наряду с многообразием уже известных стратегий выживания HBV и его дополнительных стратегических возможностей, которые еще не достаточно изучены [147], является поводом для беспокойства.

Самой насущной задачей становиться формирование как можно более полного представления о возможном влиянии “мутантов бегства” на эпидемиологию и профилактику гепатита В. Эта цель может быть достигнута путем активизации усилий на различных уровнях. Должны быть пересмотрены современные диагностические тест-системы, в отношении их способности выявлять мутантный вирус. Желательно появление тестов нейтрализации in vitro, позволяющих оценить способность мутанта избежать иммунной атаки. Эпидемиологические исследования необходимы для мониторинга наличия и географического распространения HBV мутантов, появления пост-иммунизационных мутаций и риска передачи их восприимчивым иммунизированным индивидуумам. Фундаментальные и прикладные исследования необходимы для понимания биологических свойств HBV вариаций и использования возможностей новых типов вакцин [52].

Несмотря на то, что, как было показано, две коммерческие НВ вакцины предотвратили инфицирование шимпанзе прототипом G145R мутанта [170], необходимо сделать еще очень многое, чтобы повысить иммуногенность современных вакцин. Интересные возможности предоставляет включение пре-S региона. Пре-S1 связывается непосредственно с рецептором гепатоцитов, пре-S2 содержит альбуминовый рецептор. Пре-S регион включает огромное количество В и Т-клеточных эпитопов и, очевидно, является важнейшей мишенью для идентификации и элиминации инфицированных гепатоцитов. Пре-S2 высокоиммуногенен, так как он содержит Т-клеточный эпитоп и способен вызвать анти-HBs ответ у мышей, не реагирующих на HBsAg-вакцины [171]. Тем не менее, подобные опыты с пре-S1 и/или пре-S2 последовательностями у людей не выявили заметного преимущества по сравнению со стандартными вакцинами [26]. Гораздо позднее, были осуществлены попытки получить клетки млекопитающих или дрожжей, на основе которых были созданы рекомбинантные пре-S вакцины, содержащие оба пре-S1 и пре-S2 региона. Некоторые из них прошли испытание на здоровых взрослых и детях, которые подтвердили их высокую иммуногенность, но из-за непродуманного плана исследования результаты были не убедительны и сравнить их с полученными для обычных вакцин достаточно сложно [51, 172, 173]. Очевидно, что данное направление исследований будет иметь дальнейшее развитие.

На животной модели было показано, что иммунизация пре-S1 вызывает пре-S1 специфический Т-клеточный ответ, который осуществляет функциональную помощь в синтезе специфических антител, направленных против S, пре-S1 и пре-S2 эпитопов, что позволяет преодолеть неотвечаемость на S и пре-S2 [174]. Далее, введение группе не ответивших на HBsAg медицинских работников единственной дозы пре-S1/пре-S2/S вакцины было достаточно для сероконверсии с появлением анти-HBs [175, 176]. Вслед за этими испытаниями был изучен эффект ревакцинации с использованием подобной рекомбинантной вакцины, содержащей S, пре-S2-S и пре-S/S белки, на огромной популяции мульти-вакцинированных нон-респондеров. Было показано, что индуцированный иммунный ответ был HLA-зависимым, Т-клеточный ответ неожиданным образом не коррелировал с гуморальным ответом и, что до двух доз вакцины было достаточно, чтобы вызвать сероконверсию с появлением анти-HBs у хронических нон-респондеров [177, 178].

Включение пре-S в НВ вакцины, однако, не окончательное решение проблемы, так как в будущем это может привести к появлению “мутантов бегства” с пре-S делецией [17]. Предполагается, что при разработке будущих, высокоэффективных вакцин следует учесть мутантные последовательности HBsAg, относящиеся ко второй петле или лежащие вне детерминанты [108, 115]. Особое внимание следует обратить на G145 в комбинации с R145.

Существует вероятность распространения мутантов HBV [57], и уже была сделана по крайней мере одна попытка создать математическую модель на основе эпидемиологических данных по распространению дикого типа [169, 179]. Модель сама по себе является результатом объединения серо-эпидемиологической модели, описывающей динамику распространения HBV [180] с моделью дикий тип/вариант [181]. Основное допущение состояло в том, что в связи с недавним появлением вакцин против гепатита В вакцинация еще не превратилась в реальную силу, действующую как фактор отбора и направляющую эволюцию вируса. Кроме того, к дополнительным условиям были отнесены: кросс-эффективность современных вакцин (0-100%), сравнимая инфекционность (варианты также инфекционны или, к примеру, на 10% менее инфекционны, чем дикий тип) и распространение (точные цифры не известны) варианта, сравнимое с диким типом, а также охват вакцинацией при рождении (0-100%). Основные выводы могут быть представлены следующим образом. Во-первых, современные вакцины эффективно контролируют инфекцию, вызываемую диким типом. Во-вторых, если вакцины обладают низкой и умеренной кросс-эффективностью, вариант становится доминирующим. Если кросс-эффективность высокая, то элиминируются оба штамма. В-третьих, менее очевиден прогноз, состоящий в том, что если вакцины будут абсолютно неэффективны в отношении варианта, понадобится не менее 50 лет для того, чтобы он стал доминантным типом. В-четвертых, спустя длительный период вакцинация с промежуточным уровнем охвата приведет к доминированию варианта, в условиях высоких цифр охвата прививками оба штамма будут элиминированы. В-пятых, серодиагностика, основанная на определении анти-HBc (использование HBsAg тестов связано с очевидным риском) не поможет в короткие сроки определить в какой степени используемые вакцины неэффективны в борьбе с вариантами. Пройдут десятилетия с момента начала вакцинации до того, как это различие станет очевидным. Даже через, к примеру, 50 лет, различия в уровне распространения анти-HBs, индуцированных вакцинацией и признанных высокоэффективными или абсолютно неэффективными в отношении появившихся мутантов, могут оставаться незначительными. Таким образом, осуществление надзора может стать реальной проблемой, а огромное количество носителей вариантов останется не выявленными. Основной вывод, который следует из вышесказанного, состоит в том, что немедленная опасность программам по контролю за инфекцией не грозит. Однако, если применяемые модели и допущения верны, ситуация коренным образом изменится в течение жизни всего лишь нескольких поколений людей, когда “мутанты бегства” займут доминирующее положение.

Другие типы мутантов, мутанты “диагностического бегства”, имеют не только клиническое значение, но также создают существенные препятствия в использовании иммунологических тестов для определения HBsAg. Нерешенным остается вопрос, как создать более надежную тест-систему. Предложения на этот счет высказывались уже не однократно [59, 182], в том числе включение S или пре-S последовательностей варианта и скрининг HBV ДНК или антител к HBcAg. Смысл этого замечания становится очевидным, когда возникает необходимость планирования соответствующей схемы лечения [183] или гарантированной проверки безопасности донорской крови [182].

Нет сомнений, что дискуссия на эту тему не закрыта и благоразумнее всего быть готовым к дальнейшему развитию событий. Современные вакцины безопасны и эффективны и должны повсеместно использоваться в универсальных программах иммунизаци. Что касается состава вакцин, то включение мутантных последовательностей в современное производство, основанное на HBsAg, возможно уже сегодня, хотя вновь возникшие мутанты безусловно поставят под сомнение эффективность этой стратегии. Помимо упомянутых экспериментальных вакцин, находящихся на стадии исследования, изучаются и альтернативные возможности, основанные на блокировании экспрессии вирусных генов на разных уровнях, которые могли бы стать дополнением существующих или перспективных терапевтических и профилактических стратегий. Генетические антивирусные стратегии включают использование рибозимов (РНК энзимы), antisense олигонуклеотидов и внутриклеточного синтеза интерферирующих пептидов или протеинов. Последний способ представляет собой вид внутриклеточной иммунизации, в результате которой образующиеся белки слияния приводят к появлению доминирующих негативных HBV мутантов (DN), способных значительно подавлять репликацию вируса. Этот подход - один из наиболее многообещающих, так как возникновение DN мутантов происходит относительно независимо от вариации последовательности в вирусном геноме и, таким образом, минимизирует риск селекции “мутантов бегства” [184]. Эти и другие новаторские подходы, в сочетании с результатами исследований человеческого генома [185, 188] и блестящими достижениями в области фармакогеномики [189] приведут к необходимости коренным образом пересмотреть до сих пор существующие в неизменном виде базисные концепции, такие как восприимчивость, инфекционные риск, коллективный иммунитет, диагноз, лечение, профилактика и представляют собой нисколько не меньше, чем зарождение революционного переворота в борьбе с вирусными и другими патогенами.

 

Цитируемая литература

[1] Zuckerman AJ. More than third of world’s population has been infected with hepatitis B virus. BMJ 1999;318:1213.

[2] Van Damme P, Kane M, Meheus A. Integration of hepatitis B vaccination into national immunisation programmes. Viral Hepatitis Prevention Board. BMJ 1997;314:1033–6.

[3] Zuckerman A. Alphabet of hepatitis viruses. Lancet 1996;347:558–9.

[4] Viral Hepatitis Prevention Board. VHPB recommendations on surveillance of hepatitis B. Viral Hepatitis 1997;5:7–8.

[5] Deinhardt F. Human viral hepatitis: hypothesis to fact. In: Hollinger FB, Lemon SM, Margolis HS, editors. Viral hepatitis and liver disease. Baltimore: Williams & Wilkins, 1991:5–11.

[6] Purcell RH. Hepatitis viruses: changing patterns of human disease. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:2401–6.

[7] Alexander GJM. Immunology of hepatitis B virus infection. Br Med Bull 1990;46:354–67.

[8] Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathogenesis. Annu Rev Immunol 1995;13:29–60.

[9] Grob P. Introduction to epidemiology and risk of hepatitis B. Vaccine 1995;13(Suppl 1):514–5.

[10] Grob PJ. Hepatitis B: virus, pathogenesis and treatment. Vaccine 1998;16:S11–6.

[11] Pugh JC, Bassendine MF. Molecular biology of hepadnavirus replication. Br Med Bull 1990;46:329–53.

[12] Dane DS, Cameron CH, Briggs NM. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis. Lancet 1970;1:695–8.

[13] Verheyen A. Influence of age, weight, length, BMI, gender, smoking behaviour, and type of vaccine on the immune response of HB vaccines. Antwerpen: University of Antwerpen, Department of Epidemiology and Social Medicine, 1998. In Dutch.

[14] Carman W, Thomas H, Domingo E. Viral genetic variation: hepatitis B virus as a clinical example. Lancet 1993;341:349–53.

[15] Summers J, O’Connell A, Millman I. Genome of hepatitis B virus: restriction enzyme cleavage and structure of DNA extracted from Dane particles. Proc Natl Acad Sci USA 1975;72:4597–601.

[16] Kaplan P, Greenman R, Gerin J, Purcell R, Robinson W. DNA polymerase associated with human hepatitis B antigen. J Virol 1973;12:995–1005.

[17] Feitelson MA. Biology of disease. Biology of hepatitis B virus variants. Lab Invest 1994;71:324–49.

[18] Tiollais P, Charnay P, Vyas GN. Biology of hepatitis B virus. Science 1981;213:406–11.

[19] Tiollais P, Pourcel C, Dejean A. The hepatitis B virus. Nature 1985;317:489–95.

[20] Desombere I. Human immune response to envelope proteins of the hepatitis B virus. Doctorate thesis, Department of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology, Ghent University, Ghent, 1998.

[21] Lee WM. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 1997;337:1733–45.

[22] Chiang PW, Jeng KS, Hu CP, Chang CM. Characterization of a cis element required for packaging and replication of the human hepatitis B virus. Virology 1992;186:701–11.

[23] Huang J, Liang TJ. A novel hepatitis B virus (HBV) genetic element with Rev response element-like properties that is essential for expression of HBV gene products. Mol Cell Biol 1993;13:7476–86.

[24] Blumberg BS, Hesser JE, Economidou I, et al. The variety of responses within a community to infection with Australia (hepatitis B) antigen. Dev Biol Stand 1975;30:270–83.

[25] Hadler SC, Margolis H. Viral hepatitis. In: Evans AS, editor. Viral infections of humans. Epidemiology and control. New York: Plenum Medical Book Company, 1998:351–91.

[26] Koziel MJ. Immunology of viral hepatitis. Am J Med 1996;100:98–109.

[27] Yamamoto K, Horikita M, Tsuda F, et al. Naturally occurring escape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropositive for antibody to hepatitis B surface antigen. J Virol 1994;68:2671–6.

[28] Carman WF. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus. J Viral Hepatitis 1997;4(Suppl 1):11–20.

[29] Howard CR, Melnick JL. Taxonomy of hepatitis B viruses. In: Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, editors. Viral hepatitis and liver disease. Turin: Edizioni Minerva Medica, 1997:847–9.

[30] Hilleman MR. Vaccine perspectives from the vantage of hepatitis B. Vaccine Research 1992;1:1–15.

[31] De Meyer S, Gong ZJ, Suwandhi W, van Pelt J, Soumillion A, Yap SH. Organ and species specificity of hepatitis B virus (HBV) infection: a review of literature with a special reference to preferential attachment of HBV to human hepatocytes. J Viral Hepatitis 1997;4:145–53.

[32] Brunetto MR, Giarin MM, Oliveri F, et al. Wild-type and e-antigen-minus hepatitis B viruses and course of chronic hepatitis. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:4186–90.

[33] Mushahwar IK, McGrath LC, Drnec J, Overby LR. Radioimmunoassay for the detection of hepatitis B e antigen and its antibody. Results of a clinical evaluation. Am J Clin Pathol 1981;76:692–7.

[34] Guidotti LG, Ishikawa T, Hobbs MV, Matzke B, Schreiber R, Chisari FV. Intracellular inactivation of the hepatitis B virus by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 1996;4:25–36.

[35] Milich DR, Chen MK, Hughes JL, Jones JE. The secreted hepatitis B precore antigen can modulate the immune response to the nucleocapsid: a mechanism for persistence. J Immunol 1998;160:2013–21.

[36] Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR. Posttranscriptional regulation of hepatitis B virus replication by the precore protein. J Virol 1997;71:345–53.

[37] Lau JYN, Wright TL. Molecular virology and pathogenesis of hepatitis B. Lancet 1993;342:1335–40.

[38] Henkler F, Koshy R. Multiple functions of the hepatitis B virus X protein. Viral Hepatitis Rev 1996;2:143–59.

[39] Buynak EB, Ro¨ hm RR, Tytell AA, Bertland AU, Lampson GP, Hillerman MR. Vaccine against human hepatitis B 1976. JAMA 1996;276:1793–5.

[40] Emini EA, Ellis RW, Miller WJ, McAleer WJ, Scolnick EM, Gerety RJ. Production and immunological analysis of recombinant hepatitis B vaccine. J Infect 1986;13(Suppl A):3–9.

[41] Spiegel A, Boutin JP, Cartel JL, et al. One year evaluation of immunogenicity conferred by a Chinese hamster ovary cell recombinant hepatitis B vaccine in a French Polynesian newborn immunization programme. Trans R Soc Trop Med Hyg 1991;85:783–7.

[42] Hauser P, Voet P, Simoen E, et al. Immunological properties of recombinant HBsAg produced in yeast. Postgrad Med J 1987;63(Suppl 2):83–91.

[43] Peˆtre J, Van Wijnendaele F, De Neys B, et al. Development of a hepatitis B vaccine from transformed yeast cells. Postgrad Med J 1987;63(Suppl 2):73–81.

[44] Wiedermann G, Ambrosch F, Kremsner P, et al. Reactogenicity and immunogenicity of different lots of a yeast-derived hepatitis B vaccine. Postgrad Med J 1987;63(Suppl 2):109–13.

[45] Ste´phenne J. Recombinant versus plasma-derived hepatitis B vaccines: issues of safety, immunogenicity and cost-effectiveness. Vaccine 1988;6(Suppl):299–303.

[46] Ste´phenne J. Development and production aspects of a recombinant yeast-derived hepatitis B vaccine. Vaccine 1990;8(Suppl):S69–73.

[47] Greenberg DP. Pediatric experience with recombinant hepatitis B vaccines and relevant safety and immunization studies. Pediatr Infect Dis J 1993;12:438–45.

[48] Peterson DL. Isolation and characterization of the major protein and glycoprotein of hepatitis B surface antigen. J Biol Chem 1981;256:6975–83.

[49] Margolis HS, Presson AC. Host factors related to poor immunogenicity of hepatitis B vaccine in adults. Another reason to immunize early. JAMA 1993;270:2971–2.

[50] Koff RS. Problem hepatitis viruses: the mutants. Am J Med 1994;96(Suppl 1A):52S–6S.

[51] Jilg W. Novel hepatitis B vaccines. Vaccine 1998;16:S65–8.

[52] Viral Hepatitis Prevention Board. VHPB consensus statement on HBV mutants and variants. Viral Hepatitis 1999;Fact Sheet 4:1–2.

[53] Magnius LO, Norder H. Subtypes, genotypes and molecular epidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability of the S-gene. Intervirology 1995;38:24–34.

[54] Ohba K, Mizokami M, Ohno T, et al. Relationships between serotypes and genotypes of hepatitis B virus: genetic classification of HBV by use of surface genes. Virus Res 1995;39:25–34.

[55] Krugman S, Stevens CE. Hepatitis B vaccine. In: Plotkin SA, Mortimer EA, editors. Vaccines. Philadelphia: Saunders, 1994:419–37.

[56] Carman WF, Zanetti AR, Karayiannis P, et al. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet 1990;336:325–9.

[57] Waters JA, Kennedy M, Voet P, et al. Loss of the common ‘‘a’’ determinant of hepatitis B surface antigen by a vaccine-induced escape mutant. J Clin Invest 1992;90:2543–7.

[58] Carman WF, Van Deursen FJ, Mimms LT, et al. The prevalence of surface antigen variants of hepatitis B virus in Papua New Guinea, South Africa, and Sardinia. Hepatology 1997;26:1658–66.

[59] Carman WF, Mimms LT. Pre-S/S gene variants of hepatitis B virus. In: Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, editors. Viral hepatitis and liver disease. Turin: Edizioni Minerva Medica, 1997:108–15.

[60] Hess C, Karayiannis P, Rabiel R, Thomas HC. Variants of the hepatitis B virus: a diagnostic and vaccine challenge. In: Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, editors. Viral hepatitis and liver disease.Turin: Edizioni Minerva Medica, 1997:974–6.

[61] Domingo E, Sabo D, Taniguchi T, Weissmann C. Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage population. Cell 1978;13:735–44.

[62] Blum HE. Variants of hepatitis B, C and D viruses: molecular biology and clinical significance. Digestion 1995;56:85–95.

[63] Chuang WL, Omata M, Ehata T, Yokosuka O, Ohto M. Concentrating missense mutations in core gene of hepatitis B virus. Evidence for adaptive mutation in chronic hepatitis B virus infection. Dig Dis Sci 1993;38:594–600.

[64] Feitelson M, Lega L, Guo J, et al. Pathogenesis of posttransfusion viral hepatitis in children with b -thalassemia. Hepatology 1994;19:558–68.

[65] Mimms L. Hepatitis B virus escape mutants: ‘‘pushing the envelope’’ of chronic hepatitis B virus infection. Hepatology 1995;21:884–7.

[66] Tu H, Xiong SD, Trepo C, Wen YM. Frequency of hepatitis B virus e-minus mutants varies among patients from different areas of China. J Med Virol 1997;51:85–9.

[67] Nowak MA, Bonho¨ ffer S, Hill AM, Bo¨ hme R, Thomas HC, McDade H. Viral dynamics in hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:4398–402.

[68] Blum HE, Moradpour D, von Weizsa ¨ cker F, Wieland S, Peters T, Rasenack JWS. Hepatitis-B-Virusmutanten – Klinische Bedeutung. Z Gastroenterol 1997;35:347–55.

[69] Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet 1989;2:588–91.

[70] Kramvis A, Bukofzer S, Kew MC, Song E. Nucleic acid sequence analysis of the precore region of the hepatitis B virus from sera of southern African black adult carriers of the virus. Hepatology 1997;25:235–40.

[71] Akarca US, Greene S, Lok AS. Detection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBsAg-positive family members. Hepatology 1994;19:1366–70.

[72] Hamasaki K, Nakata K, Nagayama Y, et al. Changes in the prevalence of HBeAg-negative mutant hepatitis B virus during the course of chronic hepatitis B. Hepatology 1994;20:8–14.

[73] Lai ME, Solinas A, Mazzoleni AP, et al. The role of pre-core hepatitis B virus mutants on the long-term outcome of chronic hepatitis B virus hepatitis. A longitudinal study. J Hepatol 1994;20:773–81.

[74] Lee YI, Hur GM, Suh DJ, Kim SH. Novel pre-C/C gene mutants of hepatitis B virus in chronic active hepatitis: naturally occurring escape mutants. J Gen Virol 1996;77:1129–38.

[75] Laras A, Koskinas J, Avgidis K, Hadziyannis SJ. Incidence and clinical significance of hepatitis B virus precore gene translation initiation mutations in e antigen-negative patients. J Viral Hepatitis 1998;5:241–8.

[76] Li JS, Tong SP, Wen YM, Vitvitski L, Zhang Q, Trepo C. Hepatitis B virus genotype A rarely circulates as an HBe-minus mutant: possible contribution of a single nucleotide in the precore region. J Virol 1993;67:5402–10.

[77] Mangia A, Chung YH, Hoofnagle JH, Birkenmeyer L, Mushahwar I, di Bisceglie AM. Pathogenesis of chronic liver disease in patients with chronic hepatitis B virus infection with serum HBeAg. Dig Dis Sci 1996;41:2447–52.

[78] Bowyer SM, van Staden L, Kew MC, Sim JG. A unique segment of the hepatitis B virus group A genotype identified in isolates from South Africa. J Gen Virol 1997;78:1719–29.

[79] Kramvis A, Kew MC. Structure and function of the encapsidation signal of hepadnaviridae. J Viral Hepatitis 1998;5:357–67.

[80] Tong SP, Li JS, Vitvitski L, Kay A, Trepo C. Evidence for a base-paired region of hepatitis B virus pregenome encapsidation signal which influences the patterns of precore mutations abolishing HBe protein expression. J Virol 1993;67:5651–5.

[81] Laskus T, Rakela J, Persing DH. The stem-loop structure of the cis-encapsidation signal is highly conserved in naturally occurring hepatitis B virus variants. Virology 1994;200:809–12.

[82] Lok AS, Akarca U, Greene S. Mutations in the pre-core region of hepatitis B virus serve to enhance the stability of the secondary structure of the pre-genome encapsidation signal. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:4077–81.

[83] Ogata N, Miller RH, Ishak KG, Purcell RH. The complete nucleotide sequence of a pre-core mutant of hepatitis B virus implicated in fulminant hepatitis and its biological characterization in chimpanzees. Virology 1993;194:263–76.

[84] Brunetto MR, Stemler M, Bonino F, et al. A new hepatitis B virus strain in patients with severe anti-HBe positive chronic hepatitis B. J Hepatol 1990;10:258–61.

[85] Fujiwara K, Yokosuka O, Ehata T, et al. The two different states of hepatitis B virus DNA in asymptomatic carriers: HBe-antigen-positive versus anti-HBe-positive asymptomatic carriers. Dig Dis Sci 1998;43:368–76.

[86] Maruyama T, Kuwata S, Koike K, et al. Precore wild-type DNA and immune complexes persist in chronic hepatitis B after seroconversion: no association between genome conversion and seroconversion. Hepatology 1998;27:245–53.

[87] Laskus T, Persing DH, Nowicki MJ, Mosley JW, Rakela J. Nucleotide sequence analysis of the precore region in patients with fulminant hepatitis B in the United States. Gastroenterology 1993;105:1173–8.

[88] Aye TT, Uchida T, Becker SO, et al. Variations of hepatitis B virus precore/core gene sequence in acute and fulminant hepatitis B. Dig Dis Sci 1994;39:1281–7.

[89] Hasegawa K, Huang J, Rogers SA, Blum HE, Liang TJ. Enhanced replication of a hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis. J Virol 1994;68:1651–9.

[90] Kramvis A, Kew MC, Bukofzer S. Hepatitis B virus precore mutants in serum and liver of southern African blacks with hepatocellular carcinoma. J Hepatol 1998;28:132–41.

[91] Bertoletti A, Ferrari C, Fiaccadori F, et al. HLA class I-restricted human cytotoxic T cells recognize endogenously synthesized hepatitis B virus nucleocapsid antigen. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:10445–9.

[92] Gu¨ nther S, Baginski S, Kissel H, et al. Accumulation and persistence of hepatitis B virus core gene deletion mutants in renal transplant patients are associated with end-stage liver disease. Hepatology 1996;24:751–8.

[93] Yuan TT, Lin MH, Qiu SM, Shih C. Functional characterization of naturally occurring variants of human hepatitis B virus containing the core internal deletion mutation. J Virol 1998;72:2168–76.

[94] Ehata T, Omata M, Yokosuka O, Hosoda K, Ohto M. Varia-tions in codons 84-101 in the core nucleotide sequence correlate with hepatocellular injury in chronic hepatitis B virus infection. J Clin Invest 1992;89:332–8.

[95] Akarca US, Lok AS. Naturally occurring hepatitis B virus core gene mutations. Hepatology 1995;22:50–60.

[96] Carman WF. Variation in the core and X genes of hepatitis B virus. Intervirology 1995;38:75–88.

[97] Feitelson MA, Duan LX, Guo J, et al. Precore and X region mutants in hepatitis B virus infections among renal dialysis patients. J Viral Hepatitis 1995;2:19–31.

[98] Gray AH, Fang JW, Davis GL, et al. Variations of hepatitis B virus core gene sequence in western patients with chronic hepatitis B infection. J Viral Hepatitis 1997;4:371–8.

[99] Bertoletti A, Sette A, Chisari FV, et al. Natural variants of cytotoxic epitopes are T-cell receptor antagonists for antiviral cytotoxic T cells. Nature 1994;369:407–10.

[100] Fujii H, Monyama K, Sakamoto N, et al. Gly 145 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hep-atitis B virus. Biochem Biophys Res Commun 1992;184:1152–7.

[101] Zuckerman AJ, Harrison TJ, Oon CJ. Mutations in S region of hepatitis virus. Lancet 1994;343:737–8.

[102] Carman WF, Korula J, Wallace L, MacPhee R, Mimms L, Decker R. Fulminant reactivation of hepatitis B due to envel-ope protein mutant that escaped detection by monoclonal HBsAg ELISA. Lancet 1995;345:1406–7.

[103] Hsu HY, Chang MH, Ni Y-H, Lin HH, Wang SM, Chen DS. Surface gene mutants of hepatitis B virus in infants who develop acute or chronic infections despite immunoprophylaxis. Hepatology 1997;26:786–91.

[104] Zuckerman AJ, Zuckerman JN. Molecular epidemiology of hepatitis B virus mutants. J Med Virol 1999;58:193–5.

[105] Oon CJ, Lim GK, Ye Z, et al. Molecular epidemiology of hepatitis B virus vaccine variants in Singapore. Vaccine 1995;13:699–702.

[106] Nainan OV, Stevens CE, Taylor PE, Margolis HS. Hepatitis B virus (HBV) antibody resistant mutants among mothers and infants with chronic HBV infection. In: Rizetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, editors. Viral hepatitis and liver disease. Turin: Edizioni Minerva Medica, 1997:132–4.

[107] Ogata N, Zanetti AR, Yu M, Miller RH, Purcell RH. Infectiv-ity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis B virus that emerged in a vaccinated infant. J Infect Dis 1997;175:511–23.

[108] Okamoto H, Yano K, Nozaki Y, et al. Mutations within the S gene of hepatitis B virus transmitted from mothers to babies immunized with hepatitis B immune globulin and vaccine. Pediatr Res 1992;32:264–8.

[109] Karthigesu VD, Allison LM, Fortuin M, Mendy M, Whittle HC, Howard CR. A novel hepatitis B virus variant in the sera of immunized children. J Gen Virol 1994;75:443–8.

[110] McMahon G, Ehrlich PH, Moustafa ZA, et al. Genetic alterations in the gene encoding the major HBsAg: DNA and

immunological analysis of recurrent HBsAg derived from monoclonal antibody-treated liver transplant patients. Hepatology 1992;15:757–66.

[111] Carman WF, Trautwein C, van Deursen FJ, et al. Hepatitis B virus envelope variation after transplantation with and without hepatitis B immune globulin prophylaxis. Hepatology 1996;24:489–93.

[112] Hawkins AE, Gilson RJ, Gilbert N, et al. Hepatitis B virus surface mutations associated with infection after liver transplantation. J Hepatol 1996;24:8–14.

[113] Hino K, Okuda M, Hashimoto O, et al. Glycine-to-arginine substitution at codon 145 of HBsAg in two infants born to hepatitis B e antigen-positive carrier. Dig Dis Sci 1995;40:566– 70.

[114] Oon CJ, Tan KL, Harrison T, Zuckerman A. Natural history of hepatitis B surface antigen mutants in children. Lancet 1996;348:1524.

[115] Oon CJ, Chen WN. Current aspects of hepatitis B surface antigen mutants in Singapore. J Viral Hepatitis 1998;5(Suppl2):17–23.

[116] Wallace LA, Echevarria JE, Echevarria JM, Carman WF. Molecular characterization of envelope antigenic variants of hepatitis B virus from Spain. J Infect Dis 1994;170:1300–3.

[117] Melegari M, Bruno S, Wands JR. Properties of hepatitis B virus pre-S1 deletion mutants. Virology 1994;199:292–300.

[118] Fernholz D, Galle PR, Stemler M, Brunetto M, Bonino F, Will H. Infectious hepatitis B virus variant defective in pre-S2 protein expression in a chronic carrier. Virology 1993;194:137– 48.

[119] Gerner PR, Friedt M, Ottinger R, Lausch E, Wirth S. The hepatitis B virus seroconversion to anti-HBe is frequently associated with HBV genotype changes and selection of preS2-defective particles in chronically infected children. Virology 1998;245:163–72.

[120] Gerken G, Kremsdorf D, Capel F, et al. Hepatitis B defective virus with rearrangements in the preS gene during chronic HBV infection. Virology 1991;183:555–65.

[121] Kim SL, Wright T. The clinical significance of hepatitis B mutations. Am J Gastroenterol 1996;91:1297–8.

[122] Caselmann WH, Meyer M, Kekule´ AS, Lauer U, Hofschneider PH, Koshy R. A trans-activator function is generated by inte-gration of hepatitis B virus preS/S sequences in human hepatocellular carcinoma DNA. Proc Natl Acad Sci USA

1990;87:2970–4.

[123] Ono-Nita SK, Kato N, Shiratori Y, et al. Susceptibility of lamivudine-resistant hepatitis B virus to other reverse transcrip-tase inhibitors. J Clin Invest 1999;103:1635–40.

[124] Ling R, Mutimer D, Ahmed M, et al. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology 1996;24:711–3.

[125] Tipples GA, Ma MM, Fischer KP, Bain VG, Kneteman NM, Tyrrell DL. Mutation in HBV RNA-dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology 1996;24:714–7.

[126] Chayama K, Suzuki Y, Kobayashi M, et al. Emergence and takeover of YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term lamivudine therapy and retakeover by wild type after cessation of therapy. Hepatology 1998;27:1711–6.

[127] Pichoud C, Seigne`res B, Wang Z, Trepo C, Zoulim F. Transient selection of a hepatitis B virus polymerase gene mutant associated with a decreased replication capacity and famciclovir resistance. Hepatology 1999;29:230–7.

[128] Ladner SK, Miller TJ, Otto MJ, King RW. The hepatitis B virus M539V polymerase variation responsible for 3TC resis-tance also confers cross-resistance to other nucleoside analogues. Antiviral Chem Chemother 1998;9:65–72.

[129] De Man RA, Bartholomeusz AI, Niesters HG, Zondervan PE, Locarnini SA. The sequential occurrence of viral mutations in a liver transplant recipient re-infected with hepatitis B: hepatitis B immune globulin escape, famciclovir non-response, followed by lamivudine resistance resulting in graft loss. J Hepatol 1998;29:669–75.

[130] Blum HE, Galun E, Liang TJ, von Weizsa ¨ cker F, Wands JR. Naturally occurring missense mutation in the polymerase gene terminating hepatitis B virus replication. J Virol 1991;65:1836– 42.

[131] Seto E, Mitchell PJ, Yen TS. Transactivation by the hepatitis B virus X protein depends on AP-2 and other transcription factors. Nature 1990;344:72–4.

[132] Kekule´ AS, Lauer U, Weiss L, Luber B, Hofschneider PH. Hepatitis B virus transactivator HBx uses a tumour promoter signalling pathway. Nature 1993;361:742–5.

[133] Arbuthnot P, Capovilla A, Kew M. Putative role of hepatitis B virus X protein in hepatocarcinogenesis: effects on apoptosis, DNA repair, mitogen-activated protein kinase and JAK.... STAT pathways. J Gastroenterol Hepatol 2000;15:357–68.

[134] Takada S, Koike K. Trans-activation function of a 3' truncated X gene-cell fusion product from integrated hepatitis B virus DNA in chronic hepatic tissues. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:5628–32.

[135] Wang WL, London T, Lega L, Feitelson MA. HBxAg in the liver from carrier patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Hepatology 1991;14:29–37.

[136] Repp R, Keller C, Borkhardt A, et al. Detection of a hepatitis B virus variant with a truncated X gene and enhancer II. Archiv Virol 1992;125:299–304.

[137] Uchida T, Gotoh K, Shikata T. Complete nucleotide sequences and the characteristics of two hepatitis B virus mutants causing serologically negative acute or chronic hepatitis B. J Med Virol 1995;45:247–52.

[138] Fukuda R, Ishimura N, Kushiyama Y, et al. Hepatitis B virus with X gene mutation is associated with the majority of serologically ‘silent’ non-B, non-C chronic hepatitis. Microbiol Im-munol 1996;40:481–8.

[139] Okamoto H, Tsuda F, Akahane Y, et al. Hepatitis B virus with mutations in the core of the promoter for an e antigen-negative phenotype in carriers with antibody to e antigen. J Virol 1994;68:8102–10.

[140] Kim SH, Hong SP, Kim SK, Lee WS, Rho HM. Replication of a mutant hepatitis B virus with a fused X-C reading frame in hepatoma cells. J Gen Virol 1992;73:2421–4. [141] Kramvis A, Kew MC. The core promoter of hepatitis B virus.

J Viral Hepatitis 1999;6:415–27.

[142] Gu¨ nther S, Piwon N, Will H. Wild-type levels of pregenomic RNA and replication but reduced pre-C RNA and e-antigen synthesis of hepatitis B virus with C(1653)® T, A(1762)® T and G(1764)® A mutations in the core promoter. J Gen Virol 1998;79:375–80.

[143] Kidd-Ljunggren K, Oberg M, Kidd AH. Hepatitis B virus X gene 1751 to 1764 mutations: implications for HBeAg status and disease. J Gen Virol 1997;78:1469–78.

[144] Moradpour D, Wands JR, Melegari M. Chasing the escape mutant. Hepatology 1993;18:1011-4.

[145] Carman WF. Molecular variants of hepatitis B virus. Clin Lab Med 1996;16:407–28.

[146] Davis GL. Hepatitis B: diagnosis and treatment. South Med J 1997;90:866–70.

[147] Rosenberg W. Mechanisms of immune escape in viral hepatitis. Gut 1999;44:759–64.

[148] Marrack P, Kappler J. Subversion of the immune system by pathogens. Cell 1994;76:323–32.

[149] Watkins BA, Buge S, Aldrich K, et al. Resistance of human immunodeficiency virus type 1 to neutralization by natural antisera occurs through single amino acid substitutions that cause changes in antibody binding at multiple sites. J Virol 1996;70:8431–7.

[150] Chisari FV, Ferrari C. Hepatitis B virus immunopathology. Springer Semin Immunopathol 1995;17:261–81.

[151] Carman WF, Boner W, Fattovich G, et al. Hepatitis B virus core protein mutations are concentrated in B cell epitopes in progressive disease and in T helper cell epitopes during clinical remission. J Infect Dis 1997;175:1093–100.

[152] De St Groth F, Webster RG. Disquisitions on original antigenic sin. I. Evidence in man. J Exp Med 1966;124:331–45.

[153] De St Groth F, Webster RG. Disquisitions on original antigenic sin. II. Proof in lower creatures. J Exp Med 1966;124:347–61.

[154] Klenerman P, Zinkernagel RM. Original antigenic sin impairs cytotoxic T lymphocyte responses to viruses bearing variant epitopes. Nature 1998;394:482–5.

[155] Kundu SK, Dupuis M, Sette A, et al. Role of preimmunization virus sequences in cellular immunity in HIV-infected patients during HIV type 1 MN recombinant gp160 immunization. AIDS Res Hum Retroviruses 1998;14:1669–78.

[156] Berry JD, Peeling RW, Brunham RC. Analysis of the original antigenic sin antibody response to the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. J Infect Dis 1999;179:180–6.

[157] Taylor RR, Egan A, McGuiness D, et al. Selective recognition of malaria antigens by human serum antibodies is not genetically determined but demonstrates some features of clonal imprinting. Int Immunol 1996;8:901–15.

[158] Roychoudhury S, Faruqi AF, Shih C. Pregenomic RNA encapsidation analysis of eleven missense and nonsense polymerase mutants of human hepatitis B virus. J Virol 1991;65:3617–24.

[159] Miska S, Gu¨ nther S, Vassilev M, Meisel H, Pape G, Will H. Heterogeneity of hepatitis B virus C-gene sequences: implications for amplification and sequencing. J Hepatol 1993;18:53– 61.

[160] Okamoto H, Wang Y, Tanaka T, Machida A, Miyakawa Y, Mayumi M. Trans-complementation among naturally occurring deletion mutants of hepatitis B virus and integrated viral DNA for the production of viral particles with mutant genomes in hepatoma cell lines. J Gen Virol 1993;74:407–14.

[161] Weinberger KM, Zoulek G, Bauer T, Bo¨ hm S, Jilg W. A novel deletion mutant of hepatitis B surface antigen. J Med Virol 1999;58:105–10.

[162] Chong-Jin O, Wei Ning C, Shiuan K, Gek Keow L. Identifica-tion of hepatitis B surface antigen variants with alterations outside the ‘‘a’’ determinant in immunized Singapore infants. J Infect Dis 1999;179:259–63.

[163] Oon CJ. Evolution and transmission of hepatitis B virus mu-tants. In: Zuckerman AJ, editor. Hepatitis B in the Asia-Pacific region. London: Royal College of Physicians, 1997:177–90.

[164] Nayersina R, Fowler P, Guilhot S, et al. HLA A2 restricted cytotoxic T lymphocyte responses to multiple hepatitis B surface antigen epitopes during hepatitis B virus infection. J Im-munol 1993;150:4659–71.

[165] Harrison TJ, Hopes EA, Oon CJ, Zanetti AR, Zuckerman AJ. Independent emergence of a vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus. J Hepatol 1991;13(Suppl 4):S105–7.

[166] Harrison TJ, Zuckerman AJ. Hepatitis B virus antibody escape mutants. Drug News Perspect 1993;6:271–3.

[167] Liang TJ, Hasegawa K, Mun˜ oz SJ, et al. Hepatitis B virus precore mutation and fulminant hepatitis in the United States. A polymerase chain reaction-based assay for the detection of specific mutation. J Clin Invest 1994;93:550–5.

[168] Ngui SL, O’Connell S, Eglin RP, Heptonstall J, Teo CG. Low detection rate and maternal provenance of hepatitis B virus S gene mutants in cases of failed postnatal immunoprophylaxis in England and Wales. J Infect Dis 1997;176:1360–5.

[169] Wilson JN, Nokes DJ, Carman WF. The predicted pattern of emergence of vaccine-resistant hepatitis B: a cause for concern? Vaccine 1999;7:973–8.

[170] Purcell RH. Hepatitis B virus mutants and efficacy of vaccination. Lancet 2000;356:769.

[171] Milich DR, Thornton GB, Neurath AR, et al. Enhanced immunogenicity of the pre-S region of hepatitis B surface antigen. Science 1985;228:1195–9.

[172] Raz R, Dagan R, Gallil A, Brill G, Kassis I, Koren R. Safety and immunogenicity of a novel mammalian cell-derived recombinant hepatitis B vaccine containing pre-S1 and pre-S2 anti-gens in children. Vaccine 1996;14:207–11.

[173] Bertino JS Jr., Tirrell P, Greenberg RN, et al. A comparative trial of standard or high-dose S subunit recombinant hepatitis B vaccine versus a vaccine containing S subunit, pre-S1, and of healthy adult nonresponders. J Infect Dis 1997;175:678–81.

[174] Milich DR, McLachlan A, Chisari FV, Kent SB, Thornton GB. Immune response to the pre-S(1) region of the hepatitis B surface antigen (HBsAg): a pre-S(1)-specific T cell response can bypass nonresponsiveness to the pre-S(2) and S regions of

HBsAg. J Immunol 1986;137:315–22.

[175] Zuckerman JN, Sabin C, Craig FM, Williams A, Zuckerman AJ. Immune response to a new hepatitis B vaccine in healthcare workers who had not responded to standard vaccine: ran-domised double blind dose-response study. BMJ 1997;314:329–

33.

[176] McDermott AB, Cohen SB, Zuckerman JN, Madrigal JA. Hepatitis B third-generation vaccines: improved response and conventional vaccine non-response. Evidence for genetic basis in humans. J Viral Hepatitis 1998;5(Suppl 2):9 –11.

[177] McDermott AB, Cohen SB, Zuckerman JN, Madrigal JA. Human leukocyte antigens influence the immune response to a pre-S/S hepatitis B vaccine. Vaccine 1999;17:330–9.

[178] McDermott AB, Madrigal JA, Sabin CA, Zuckerman JN, Cohen SB. The influence of host factors and immunogenetics on lymphocyte responses to Hepagene ® vaccination. Vaccine 1999;17:1329–37.

[179] Wilson JN, Nokes DJ, Carman WF. Current status of HBV vaccine escape variants. A mathematical model of their epi-demiology. J Viral Hepatitis 1998;5(Suppl 2):25–30.

[180] Edmunds WJ, Medley GF, Nokes DJ. The transmission dy-namics and control of hepatitis B virus in the Gambia. Stat Med 1996;15:2215–33.

[181] McLean AR. Vaccination, evolution and changes in the efficacy of vaccines: a theoretical framework. Proc R Soc Lond [Biol] 1995;261:389–93.

[182] Jongerius JM, Wester M, Cuypers HT, et al. New hepatitis B virus mutant form in a blood donor that is undetectable in several hepatitis B surface antigen screening assays. Transfusion 1998;38:56–9.

[183] BoxaIl EH. Hepatitis B envelope protein mutants. Lancet 1995;346:319.

[184] Von Weizsa ¨ cker F, Wieland S, Ko¨ ck J, et al. Gene therapy for chronic viral hepatitis: ribozymes, antisense oligonucleotides, and dominant negative mutants. Hepatology 1997;26:251–5.

[185] Rumyantsev SN. Observations on constitutional resistance to infection. Immunol Today 1992;13:184–7.

[186] Marshall E. A high-stakes gamble on genome sequencing. Science 1999;284:1906–9.

[187] Marshall E. Human genome project. Sequencers endorse plan for a draft in one year. Science 1999;284:1439–41.

[188] Van Ommen GJB, Bakker E, den Dunnen JT. The human genome project and the future of diagnostics, treatment, and prevention. Lancet 1999;354(Suppl 1):SI5–SI10.

[189] Wickelgren I. Mining the genome for drugs. Science 1999;285:998–1001.