Merck Institute, 770 Sumneytown Pike, West Point, PA 19486, USA

Гепатит В можно поставить первым в ряду вирусных гепатитов человека и по распространенности заболевания и по частоте персистирования инфекции, которая впоследствии может привести к циррозу и раку печени. Патология HBV-инфекции обусловлена главным образом деструктивным ответом цитотоксических Т-лимфоцитов хозяина. Эти реакции модулируются растворимым пре-сердцевинным е-антигеном, который может вызывать иммунологическую толерантность, и цитокинами, продуцируемыми цитотоксическими Т-клетками, которые подавляют репликацию вируса в инфицированных клетках. На патогенез заболевания заметное влияние оказывают вирусные мутации. Персистирующую HBV-инфекцию у незначительной части больных можно контролировать пассивной a -интерферонотерапией, и у большинства, пока не разовьется резистентность, с помощью нуклеозида ламивудина. Самым оптимальным способом контроля над заболеванием является его предупреждение путем введения высокоэффективной вакцины, изготовленной на основе поверхностного антигена вируса. Показано, что расширение практики иммунизации против гепатита В во всем мире может привести к элиминации этой инфекции. В статье собраны последние представления, касающиеся патогенеза, профилактики и терапии вирусного гепатита В.

Термин “Гепатит”, или воспаление печени, используется для обозначения орган-специфических клинических проявлений самой разнообразной этиологии и патогенеза. В настоящее время известны вирусы, принадлежащие, по крайней мере, к шести различным семействам [1-3] (Таблица 1), вызывающие гепатит у человека. Вирусы TTV [1,2] и SEN-V [3] были описаны совсем недавно и их клиническое значение, также как и G-GB агентов, еще недостаточно хорошо известно. Имеются все основания полагать, что некоторые инфекционные агенты, вызывающие заболевание человека оральным путем, могут иметь зоонозное происхождение. Разрабатывается гипотеза о происхождении вируса гепатита В человека от аналога у шимпанзе [4-6].

HBV, так же как и ВИЧ, размножается в альтернативном ДНК или РНК жизненном цикле (см.[7-9]). Целый вирион или частица Дейна (Рис.1) представляет собой заключенную в оболочку сферу диаметром 42 нм. Оболочка состоит из фосфолипидного бислоя, в который погружены поверхностные антигены. Нуклеокапсид, или ядро, лежит внутри оболочки и является генетическим аппаратом вируса. Геном вируса гепатита В, содержащий 3,2 Kb информации (см.[8, 10]), изображен в линейном виде на Рис.2. Это частично двуцепочечная ДНК, имеющая круговую конфигурацию. Пре-сердцевинный (pre-core) участок ядра (с) кодирует е-антиген, который секретируется из клетки и вступает в циркуляцию.

Остальные ядерные гены кодируют белки вирусного капсида. Растворимый е-антиген обусловливает иммунологическую специфичность нуклеокапсида и соответсвующих цитотоксических Т-лимфоцитов. Антигены оболочки, которые расположены в фосфолипидном бислое, имеют димерную конфигурацию и включают малый (S), средний (S плюс pre-S2) и большой (S плюс pre-S2 и –S1) протеины, в зависимости от положения начала транскрипции. S-антиген дикого вируса чрезвычайно устойчив и определяет общую а-антигенную детерминанту вирусов гепатита В. Во время вирусной репликации образуется излишек поверхностного антигена, который циркулирует в крови вирусоносителей в виде сферы или бруска диаметром 22 нм, представляющего собой белково-липидную композицию [11]. Ген полимеразы (pol) кодирует ДНК-полимеразу - обратную транскриптазу. Х ген кодирует регуляторные (трансактивирующие) белки.

На рисунке для сравнения также показана генетическая карта ВИЧ. Рассматриваемые вирусы возможно имеют дальнее филогенетическое родство [12-14]. В обоих геномах встречаются многократно повторяющиеся gag, pol и en6 гены, что характерно для всех вирусов, имеющих оболочку. Вирус гепатита В, как и ВИЧ, подвержен мутациям в результате ошибок в обратной транскрипции ДНК на одноцепочечной РНК, для которой не предусмотрено проверки считывания. В отличие от ВИЧ, небольшой геном вируса НВ имеет обширные перекрывающиеся области в рамках считывания, особенно для en6 и pol генов, что ограничивает возможность образования мутантов, сохраняющих способность к репликации. Однако жизнеспособные мутанты встречаются довольно часто и имеют селективное преимущество перед лицом специфического иммунного ответа хозяина и антивирусной терапии. Ограничение жизнеспособности мутантов возможно вносит свой вклад в относительную консервативность структуры поверхностного антигена, в противоположность ВИЧ, для которого характерна антигенная гипервариабельность. Вирус гепатита В, однако, имеет по крайней мере 6 [15, 16] или, возможно, 7 [17] генотиповгшг788 и 4 принципиальных субтипа, близких по структуре высоко консервативной нейтрализующей а-антиген-специфической петли. Кроме того, возможны перестройки генных последовательностей между штаммами с различными генотипами [15, 16].

1. Патогенез

Патогенез HBV инфекции подробно описан в других обзорах [10, 18-23], детали которых не будут повторяться в этой статье.

Гепатит, вызываемый НВ вирусом, чрезвычайно загадочное заболевание. Вирус не является цитопатогенным. Подавляющее большинство повреждений носит иммунопатологический характер и возникает в результате иммунных реакций хозяина, направленных против инфицированных клеток печеночной паренхимы. Наиболее часто встречающейся формой инфекции ВГВ является самоограничивающийся гепатит. Он особенно характерен для пациентов, у которых развивается мощный первичный иммунный ответ, часто имеющий клиническую манифестацию. У другой части инфицированных людей, чей иммунный ответ не настолько силен, возможен переход в персистирующую инфекцию, и выздоровление наступает очень медленно, или не наступает вовсе. Заболевание может перейти в хроническую форму с характерными периодами ремиссии и обострения, с возможным смертельным исходом от фульминантного гепатита, цирроза печени, гепатоцеллюлярной

Таблица 1

Известные вирусы гепатита человека.

Обозначение	Геном (Kb)	Семейство	Путь передачи	Персистенция
A (РНК)	7.5	Picornavirus	Орально-фекальный	нет
В (ДНК)	3.2	Hepadnavirus	Кровь, секс	да
С (РНК)	9.4	Flavivirus	Кровь, секс	да
D (РНК)	1.7	Viroid	Кровь, секс	да
Е (РНК)	7.5	Calicivirus	Орально-фекальный	нет
G (РНК)	9.1	Flavivirus	Кровь	да
GBa (РНК)	9.1	Flavivirus	Кровь	да
GBb (РНК)	9.1	Flavivirus	Кровь	да
TTV (ДНК)	?	Circinovirus	Кровь (кишечник?)	да
SEN-V	?	?	Кровь	да

 

Таблица 2

Гепатит В – заболевание и его последствия

 

Последствия гепатита В при хроническом вирусоносительстве: хроническое заболевание печени, цирроз, гепатокарцинома

Распространенность:

1/3 населения инфицирована HBV

350 миллионов вирусоносителей

1-2 миллиона умирает ежегодно

Вероятность персистенции инфекции:

90% при перинатальном заражении ребенка HbeAg-позитивной матери

30% в дошкольном периоде

5-10% во взрослом возрасте

Высокая вероятность заражения:

Переливание контаминированной крови

Инъекции контаминированной крови – наркомания

Производные контаминированнолй крови

Беспорядочные половые отношения

HBV более чем в 100 раз по контагиозности превосходит ВИЧ.

_____________________________________________________________________

карциномы, или от цирроза и рака одновременно. Сегменты вирусной ДНК в случайном порядке могут встраиваться в геном гепатоцитов. Уровень смертности от хронического персистирующего гепатита составляет свыше 25%. У выздоровевших в крови присутствуют антитела против S, сердцевинного (ядерного) и е-антигенов, а также может сохраняться на низком уровне персистенция вируса.

Таблица 3

Патогенез гепатита В

 

HBV не оказывает цитопатогенного действия. Повреждения носят иммунопатологический характер.

Исход заболевания в зависимости от иммунного ответа хозяина:

Мощное реагирование приводит к спонтанному выздоровлению

Умеренное – может привести к персистенции инфекции

Медленное разрешение инфекции

Персистирующая инфекция

Хронический гепатит

Фульминантный гепатит

Хронический активный гепатит – ремиссии и обострения

Смертность – 25% (цирроз, рак)

Случайное встраивание сегментов вирусной ДНК в геном клеток хозяина

____________________________________________________________

Роль иммунологических реакций в патогенезе заболевания.

На самом раннем этапе развития иммунного ответа хозяина (Таблица 4) основная роль принадлежит неспецифическим иммунным механизмам [23]. Эффекторы специфического адаптивного иммунного ответа принадлежат к двум видам. Это – Антитела, которые снижают вирусный груз и предотвращают поражение неинфицированных клеток, и CD8+ Т-лимфоциты, которые могут вызывать разрушение инфицированных вирусом клеток по пути некроза или апоптоза, или подавлять репликацию вируса в пораженных клетках. Некровоспалительные реакции могут носить вирус-специфический и неспецифический характер, в них принимают участие макрофаги, нейтрофилы и естественные киллеры. Чаще всего, участие иммунологических механизмов защиты приводит к элиминации вируса через определенный период времени, продолжительность которого может варьировать. Когда персистенция вируса сохраняется, клиническая картина может быть самой разнообразной – от инаппарантной инфекции до фульминантного гепатита со смертельным исходом, или хронической активной инфекции с периодами клинической ремиссии и обострения, различной степени тяжести. Смерть от цирроза печени или гепатокарциномы наступает у 20-25% вирусоносителей.

Таблица 4

Роль иммунных реакций в патогенезе гепатита В

 На ранних этапах развития иммунного ответа основная роль принадлежит врожденным неспецифическим механизмам защиты, включая цитокины и другие эффекторы

К эффекторам специфического адаптивного иммунного ответа относятся:

Антитела, снижающие вирусную нагрузку и предотвращающие заражение

CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты вызывают:

Некровоспалительные реакции

Апоптоз

Супрессию вирусной репликации

Участие механизмов иммунологической защиты обычно приводит к элиминации вируса

Клиническая картина может варьировать от инаппарантной формы до фульминантного гепатита, хронической активной инфекции с периодами ремиссии и обострений, или смертельного исхода в результате цирроза или гепатокарциномы

 

Все четыре гена HBV чрезвычайно подвержены разнообразным мутациям [24-28]. Молекулярные изменения, лежащие в их основе, являются предметом всестороннего изучения. Еще более грандиозной задачей является прогнозирование клинических последствий таких изменений. Подобные исследования трудно выполнимы, особенно в отсутствии средств для размножения вируса in vitro. В последней публикации Brunetto и сотр. [24] суммированы типы и количество мутаций, обнаруженных в pre-core/core, pre-S/S, и pol генах 55 различных вирусных изолятов (Таблица 5). Как и можно было ожидать, наиболее часто мутации затрагивают pre-core/core ген с заменой пуринов на пиримидины и наоборот. Лишь в X гене не было обнаружено делеций, в то время как в трех других генах встречались мутации различных типов.

Таблица 5

Мутационные изменения HBV генома

Мутация	Pre-core/core	Pre-S/S	Полимераза	Общее число
Транзиция	16	6	5	27
Вставка	5	-	7	12
Трансверсия	8	3	-	11
Делеция	5	-	-	5
Общее число	34	9	12	55

Источник: Brunetto. Intervirology 42:69, 1999.

На сегодняшний день лишь для относительно небольшого количества мутаций известно их влияние на клиническое течение инфекции. Наиболее хорошо изученная мутация относиться к pre-core и core генам, ответственным за поверхностные антигены. Появление в pre-core регионе стоп-кодона приводит к блокированию синтеза HBeAg, в результате больные остаются HBeAg-отрицательными, клиническое значение этой мутации ещё не до конца понятно [25]. Мутации базального ядерного промотора приводят к снижению продукции е-антигена, что обусловливает увеличение репликации вируса и обострению заболевания. Белки оболочки HBV индуцируют и гуморальный и клеточный иммунный ответ. S антиген вызывает продукцию нейтрализующих антител и используется для производства вакцин. Наиболее часто встречаемая мутация находится в позиции 145 аминокислоты а-антигенной петли, она приводит к изменению иммунологической специфичности поверхностного антигена и является причиной появления “иммунных вирусоносителей”, которые имеют антитела к поверхностному антигену дикого вируса [28]. Деффекты pol гена были обнаружены у вируса, выделенного от пациентов, у которых сформировалась резистентность к антивирусной терапии. Многочисленные мутации были идентифицированы в Х гене, однако выводов об их клинической значимости еще не сделано.

2. Уточнение патогенеза HBV-инфекции в опытах на трансгенных мышах и исследованиях людей.

Выяснить детали патогенеза HBV-инфекции было бы невозможно без привлечения модельных экспериментов с использованием трансгенных мышей [29]. В настоящей статье основное внимание уделяется результатам, полученным Milich, Brunetto и Chisari с соавторами.

1. Роль е-антигена

Milich и сотр. в 1990 году предположили (Таблица 6), что растворимый е-антиген проникает через плаценту беременных мышей и вызывает иммунологическую толерантность к кросс-реактивным HBeAg и антигенам нуклеокапсида на уровне специфических Т-хелперных клеток. Существующие данные свидетельствуют о том, что механизм формирования толерантности состоит в элиминации (истощении), по-видимому, в тимусе, популяции Т-хелперных клеток, специфичных к кросс-реактивным HBeAg и антигенам нуклеокапсида. Это открытие примечательно тем, что толерантность к HBeAg объясняет высокую вероятность персистирующей инфекции, приобретенной в утробе или перинатально новорожденными HBeAg-позитивных матерей-вирусоносительниц. Кроме того, е-антиген может участвовать в индукции толерантности у взрослых, что играет определенную роль в различиях клинического течения хронической активной инфекции. Толерантность “на руку” вирусу, так как она создает условия для его персистенции в организме хозяина.

Скептицизм, с которым была встречена концепция, предложенная Milich [31], объясняется неудачными попытками переноса через плацентарный барьер е-антигена в исследованиях, проводимых на трансгенных мышах различного гаплотипа. Эти сомнения были разрешены недавно путем демонстрации [32] е-антигена в парентеральной циркуляции новорожденных, чьи матери были HBeAg-позитивными вирусоносительницами.

За последние 10 лет Milich [33, 34] развернул свою оригинальную гипотезу до постулата, что механизм формирования HBeAg-толерантности у взрослых состоит в преимущественной индукции невоспалительного Тh-2 ответа путем периферической делеции Т-хелперов 1 типа Fas-опосредованным апоптозом, как было показано на трансгенных мышах. Снижение цитотоксического Т-клеточного ответа обусловливает длительную персистенцию вируса. Эти гипотезы в основном носят спекулятивный характер, так как основываются на данных, полученных в искусственных условиях модельного эксперимента на мышах. Проведя динамическое исследование с целью выяснения роли е-антигена у пациентов с хронической HBV-инфекцией, Brunetto (и сотр.) [24] (Таблица 6) пришли к заключению, что (а) е-антиген может выступать и в роли индуктора толерантности и как мишень для клеточно-опосредованного иммунного ответа; (б) мутации в pre-core гене приводят к изменению антигенной специфичности е-антигена; (с) и дикий и мутантный HBV могут сосуществовать у одного и того же пациента, при этом важно учитывать соотношение этих двух вирусов. Brunetto делает вывод о том, что смешанные вирусные инфекции сопровожаются самой разнообразной клинической картиной заболевания. В то же время гомогенные популяции дикого типа вируса и мутанта с дефективным е-антигеном преобладают у носителей с отсутствием или незначительным поражением печени. Это важно подчеркнуть в связи с тем, что е-антиген экспрессируется на поверхности инфицированных клеток печени [35].

 

Таблица 6

Роль е-антигена в патогенезе и контроле за HBV инфекцией

Milich, et al. в 1990 году предположили, что е-антиген вызывает толерантность на уровне Т-хелперных клеток с е/core специфичностью

e-антиген проникает через плацентарный барьер и является причиной развития с высокой вероятностью персистирующей инфекции у детей, рожденных HBeAg-позитивными женщинами-вирусоносительницами. Прохождение через плаценту в настоящее время показано и для человеческого эмбриона.

Состояние толерантности, индуцированной HBeAg, у взрослых пациентов объясняет наличие периодов клинической ремиссии и обострений при хроническом активном гепатите

У трансгенных мышей е-антиген может приводить к истощению популяции Тh1, следовательно, к снижению количества цитотоксических Т-клеток и развитию персистирующей инфекции

Потеря HВeAg-специфичности при мутации вируса и неэффективный гуморальный иммунный ответ могут привести к тяжелому поражению печени

Клинические исследования Brunetto продемонстрировали:

Сосуществование дикого и е-мутантного вируса

Смешанная вирусная инфекция сопровождается варьирующей клинической картиной

Гомогенные дикий или е-мутантный вирусы вызывают незначительное поражение печени или вообще не вызывают его

 Роль цитокинов

Уже давно известно, что специфические антитела, направленные против поверхностного антигена гепатита В, предупреждают инфицирование вирусом или реинфекцию, а также снижают вирусный груз в биологических жидкостях. Известно также, что цитотоксические Т-клетки играют двоякую роль, с одной стороны участвуя в иммунном клиренсе HBV, а с другой - вызывая тяжелые повреждения печени.

Исследуя роль цитотоксических клеток в патогенезе заболевания, Chisari с соавторами [18] (Таблица 7) подсчитали, что в печени, в которой практически все клетки были инфицированы вирусом, на тысячу инфицированных гепатоцитов приходилось менее одной цитотоксической Т-клетки. Такое подавляющее преобладание потенциальных клеток-мишеней наводит на мысль о существовании какого-то дополнительного механизма опосредованного цитотоксическими Т-клетками клиренса вируса помимо прямого разрушения инфицированных клеток путем активации сигналов апоптоза и некровоспалительных реакций. Не вызывает сомнения то, что должен существовать альтернативный механизм избавления от вируса без деструктивных изменений большинства клеток печени. Исследования, проводимые на людях, мало что прояснили в этом отношении, поэтому Chisari et al.[18,36] была проведена серия экспериментов с трансгенными мышами (Таблица 7), несущими полный HBV геном. В отсутствии иммунного ответа хозяина никаких повреждающих реакций у мышей не наблюдалось. Вскоре было обнаружено, что пассивный перенос вирус-специфических цитотоксических Т-клеток приводит к клиренсу вируса посредством цитокиновых механизмов, преимущественно с участием g -IFN и TNF-a . Впоследствии было показано, что несопровождающиеся цитопатическим эффектом механизмы выведения вируса имеют место при HBV инфекции у шимпанзе [37]. Далее также выяснилось, что подобная внутриклеточная инактивация в печени происходит и при других, неродственных вирусных инфекциях (LCMV, аденовирусной, цитомегаловирусной) [18]. Цитокины, g -IFN , TNF-a и, возможно, IL-2 ингибируют экспрессию вируса и процессы репликации на уровне пост-транскрипционных событий путем дестабилизации и разрушения РНК в ядре и предупреждения сборки вирусного нуклеокапсида в цитоплазме. Недавно Guidotti и сотр. [38] предоставили доказательства того, что антивирусная активность g -IFN опосредована оксидом азота (NO).

Изучение и уточнение этих механизмов имеет принципиальное значение для объяснения того, каким образом цитотоксические Т-клетки, которые по оценкам разрушают до 5% инфицированных клеток, обеспечивают клиренс вируса, не вызывая повреждения остальных. Некроз незначительной доли инфицированных гепатоцитов объясняет серьезные, приводящие к повреждениям, воспалительные процессы, происходящие в печени. В отсутствии эффективного клиренса, осуществляемого цитокинами, например, в случаях фульминантного гепатита, происходит быстрое разрушение гепатоцитов и наступает смерть.

Таблица 7

Механизмы недеструктивного клиренса HBV

Антитела против поверхностного антигена предотвращают инфицирование вирусом или реинфекцию, а также снижают вирусную нагрузку

Цитотоксические Т-клетки обеспечивают клиренс HBV из инфицированных клеток печени

Chisari et al. было показано, что в инфицированной печени на тысячу пораженных вирусом гепатоцитов приходится менее одной цитотоксической Т-клетки

Это доказывает наличие альтернативных механизмов вирусного клиренса помимо прямой деструкции путем апоптоза и развития некровоспалительных реакций

На трансгенных мышах Chisari продемонстрировал, что пассивный перенос цитотоксических Т-клеток приводит к выведению вируса посредством цитокиновых реакций, преимущественно с участием g -IFN и TNF-a

Цитокины ингибируют экспрессию HBV путем дестабилизации и деградации вирусной РНК в ядре и предупреждения сборки нуклеокапсида в цитоплазме

Таким образом, прямое воздействие цитотоксических Т-лимфоциов приводит к разрушению небольшой части инфицированных гепатоцитов, в то время как основное антивирусное действие оказывают цитокины

Очевидно, что патогенез и разнообразие клинических вариантов хронического гепатита В – вопросы чрезвычайно сложные, и многое еще предстоит изучить, чтобы составить полное представление о протекании этой инфекции у человека. Наблюдения Milich и Brunetto с соавторами, касающиеся роли HBеAg-толерантности, и описание Chisari et al.механизмов недеструктивного клиренса вируса из инфицированных клеток примечательны в плане создания новых подходов в терапии. Они также создают основу для понимания того, как справляться с другими вирусными инфекциями, используя разработанные для гепатита В механизмы.

3. Гепатокарциногенез

Наиболее серьезными осложнениями хронического персистирующего гепатита (Таблица 8) являются цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома. Эти типичные отдаленные следствия инфекции становятся причиной смерти 25% вирусоносителей. Ко-факторами этих процессов являются алкоголь и табакокурение. Возникновение цирроза в результате длительного воспаления, гибели клеток и их замещения не трудно понять. Однако механизм и роль, которую играет вирус в индукции канцерогенеза, по-прежнему остаются загадкой. На сегодняшний день вниманию читателей предоставлена масса обзоров и сообщений [39-48], обсуждающих механизмы участия HBV инфекции в гепатокарциногенезе.

Таблица 8

Теории гепатокарциногенеза, вызванного

персистирующей HBV инфекцией

Цирроз и гепатокарцинома – отдаленные последствия хронического персистирующего гепатита

Цирроз наступает в результате длительного воспаления, гибели клеток и замещения гепатоцитов

Генез гепатокарциномы не до конца понятен

Сушествует две теории карциногенеза:

Нодулярная дисплазия:

Восстановление и замещение гепатоцитов приводит к дисплазии

Длительная токсичность, оксидативный стресс воспаления и генетическая дестабилизация могут иметь важное значение в возникновении опухоли

Подобные опухоли имеют место и в отсутствие HBV

Вирусная теория:

Прямое и продолжительное воздействие вируса на клеточный цикл приводит к иммортализации гепатоцитов, прогрессирующей в неоплазию.

В пользу этой теории выступают данные о развитии гепатокарциномы у трансгенных мышей со сверх-экспрессией вирусного поверхностного антигена, а также

Демонстрация прямой активации c myc гена у сурков

Обе теории имеют свои достоинства, а описываемые ими механизмы являются действующими

_____________________________________________________________________

Существует две школы, выдвигающие гипотезы относительно механизмов образования гепатокарциномы у вирусоносителей с хроническим заболеванием печени. Одна школа [40, 41, 45] придерживается непрямой или теории нодулярного цирроза, состоящей в том, что непрямой кумулятивный эффект процессов репарации и замещения гепатоцитов приводит к дисплазии, а следом и неоплазии. Это мультистадийный процесс, в течение которого такие факторы, как длительная токсичность и оксидативный стресс, связанный с воспалением, могут вызывать мутации ДНК, приводящие к генетической дестабилизации, играющей существенную роль в формировании неоплазии. Nakamoto (и сотр.) [41] полагают, что иммунный ответ на HBV при хронической инфекции сам по себе является необходимым и достаточным фактором канцерогенеза. Однако, важно учитывать то, что гепатокарцинома может иметь место и в отсутствии HBV.

Вторая школа поддерживает вирусную теорию [42, 44-47, 49, 50], которая состоит в том, что прямое и продолжительное воздействие дикого или мутантного вируса может оказывать влияние на клеточный цикл, приводя к появлению иммортализованных (“бессмертных”) гепатоцитов с прогрессированием в сторону неоплазии. Логично было бы ожидать данных о существовании трансактивации клеточных генов промоторами вирусного ядра, поверхностного антигена и Х гена, однако прямых доказательств нет, и эта гипотеза требует дальнейшего уточнения (см.[43]).

Таблица 9

Примеры факторов и механизмов, которые могут быть задействованы в прямом вирусном гепатокарциногенезе

Случайное встраивание вирусных генов в хромосомы клеток хозяина

Вставки вирусных генов с микро- или макро-хромосомными делециями или транслокациями

Трансактивация генов в клетках хозяина вирусным Х геном

Альтерация сигналов транскрипции или трансдукции в клетках хозяина протеинами Х гена

Активация клеточных генов вирусными промоторами, кодируемыми pre-core/core геном и свободным поверхностным протеином

Инсерционная мутация р53 анти-онкогена или связывание вирусного белка с р53

Связывание вирусного белка с афлатоксином В1, поступающим из окружающей среды, препятствует его детоксикации.

В Таблице 9 суммированы факторы и механизмы, которые объясняют возможное прямое участие вируса в возникновении гепатокарциномы. Однако, окончательные выводы ещё не сделаны. Встраивание генов вируса в геном гепатоцитов происходит в случайном порядке и не существует свидетельств того, что какой-то отдельный вариант является общим для множества имеющих место моноклональных опухолей. Кроме того, перестройки, которыми сопровождаются вставки вирусных генов, случайны и беспорядочны и не являют собой каких-либо уникальных комбинаций, которые бы помогли установить правдоподобный механизм. Всевозможные наблюдения, касающиеся трансактивации Х гена и возможного участия в альтерации транскрипции и трансдукции сигнала в клетке, не выявили никаких общих закономерностей. Активация клеточных генов вирусными промоторами остается скорее догадкой, нежели установленным фактом. Идеи относительно возможности связывания вирусных факторов с клеточными протеинами упираются в идентификацию структур, где это связывание может происходить. Однако факт повышения онкогенности афлатоксина В1 посредством связывания с вирусными протеинами доказан и должен приниматься во внимание [50]. Известно, что последние открытия, касающиеся роли вируса и факторов окружающей среды в гепатокарциногенезе, были сделаны при изучении селективной мутации р53 гена в Ser 249 положении, которая превалирует в популяции в Гамбии, где наблюдается высокий уровень и персистирующей HBV инфекции и воздействия афлатоксина [50].

В заключение можно сказать, что несомненными достоинствами обладает и нодулярная и вирусная теории патогенеза гепатокарциномы, с учетом того, что они обе носят рабочий характер. На самом деле, в обеих школах есть много общего. Можно сказать, что вирусная теория представляет собой довольно сложную и беспорядочную картину, в которой сочетается прямое и непрямое действие вируса. Большинство работ выполнено на трансгенных мышах и других животных моделях, результаты которых нельзя апроксимировать на человека, или это можно сделать лишь в незначительной степени. Трудности в изучении патогенеза HBV инфекции очевидны, однако, эта область исследований остается одной из важнейших в плане понимания общих закономерностей возникновения рака. Кроме того, принципы, установленные для гепатита В, могут иметь значение и при других вирусных неоплазиях.

Терапия хронического гепатита В

Обзор современной литературы показал, что на сегодняшний день прилагаются огромные усилия для разработки средств терапии персистирующей вирусной инфекции [51-56]. Поиски лишь частично увенчались успехом, в этом разделе будут рассмотрены самые передовые направления в терапии хронического гепатита В.

Основными подходами в решении проблемы хронического гепатита В являются: хемотерапия, биотерапия и иммунотерапия. Цель терапии (Таблица 10) состоит в элиминации и транскрипции вирусной ДНК и трансляции вирусной РНК. Показателями успешности терапии являются: специфический гуморальный ответ против е, core и поверхностного антигена, а также нормализация уровня сывороточных ферментов и исчезновение клинических симптомов заболевания.

Таблица 10

Общие цели терапии хронического гепатита В

Ингибирование размножения вируса на двух уровнях:

Транскрипции вирусной ДНК

Трансляции вирусной РНК

Благоприятные факторы:

Снижение вирусной нагрузки (пока не произошла мутация)

Элиминация вирусной ДНК

Элиминация е-антигена

Сероконверсия по отношению к е-антигену

Поверхностный антиген

Нормализация уровня сывороточных ферментов (АЛТ)

Для лечения персистирующей HBV инфекции (Таблица 11) несколько лет тому назад начали использовать альфа-интерферон [54] и нуклеозид ARA-A. ARA-A обладал исключительной нейротоксичностью. Затем использовался нуклеозид фиалуридин [52], токсичный по отношению к митохондриям, вызвавший сильнейший лактацидоз, приведший к смерти нескольких пациентов, после чего препарат был запрещен к использованию. На сегодняшний день первым препаратом выбора является нуклеозид ламивудин [53], также известный как 3ТС. Ламивудин активно подавляет HBV инфекцию, однако в течение года после начала терапии возможно появление мутантов, резистентных к действию препарата [54, 57]. Очевидно, что, как и в случае СПИД вирусной инфекции, необходимо сочетание различных лекарственных средств. В настоящее время активно изучается комбинация ламивудина и альфа-интерферона. Экспериментальную проверку проходят также новые нуклеозиды [53-57, 59], и, вероятнее всего, предпочтение будет отдаваться комбинированным препаратам.

Альфа-интерферон на протяжении многих лет использовался в экспериментальных исследованиях, а в 1992 году он был разрешен к использованию для терапии гепатита В. Этот препарат характеризуется низкой эффективностью - приблизительно в 33% случаев, кроме того он неэффективен в отношении pre-core мутантов [59, 60].

Другие цитокины, включая g -IFN, TNF-a , IL-2 и IL-12 [54, 55, 61] проходят экспериментальную проверку. Возможность использования рибозима (anti-sense ribozyme) [53, 62], внешних направляющих последовательностей (external guide sequences) [63] и тимозина [54] в терапевтических целях также изучается в лабораторных исследованиях.

Специфический HBV иммуноглобулин используется для предупреждения инфекции у новорожденных и при трансплантации печени, часто с успешным результатом. Предмет давних мечтаний - терапевтические вакцины для лечения вирусных инфекций, однако, принципиальная возможность их создания также до конца не установлена. В настоящее время испытываются вакцины, которые будут стимулировать иммунный ответ организма на природную инфекцию. Основные усилия сосредоточены на создании рекомбинантных плазмидных ДНК вакцин и липопротеидной терапевтической вакцины, состоящей из специфического HBV-эпитопа, ковалентно связанного с эпитопом столбнячного токсоида, проходящей II фазу клинических испытаний.

Таблица 11

Основные подходы к терапии персистирующей ВГВ инфекции

Хемотерапия (нуклеозидные аналоги) Ламивудин Пенцикловир Комбинации:       Биотерапия – пост-транскрипционная модификация жизненного цикла вируса Цитокины IFN-a 1, 2a, 2b g -IFN, TNF-a , IL-2, IL-12 Тимозин Рибозимы, внешние напрявляющие последовательности Иммунотерапия Специфический иммуноглобулин Антивирусная вакцина (ДНК плазмидная) Липопротеидная терапевтическая вакцина

Лицензирован Скоро будет лицензирован Ламивудин + Пенцикловир Ламивудин +IFN-a         используются давно экспериментальные исследования экспериментальные исследования экспериментальные исследования     (трансплантация печени) экспериментальные исследования экспериментальные исследования

Иммунопрофилактика

В отношении всех инфекционных заболеваний верно утверждение, что лучше предотвратить инфекцию, чем потом лечить или пытаться лечить ее. Это же можно сказать про гепатит В и вакцины, которые служат этим целям.

1. Плазменные вакцины

В течение многих десятков лет гепатит В или сывороточный гепатит был предметом изучения с точки зрения этиологии заболевания и возможности его вакцинопрофилактики (Таблица 12). Это стало возможным после открытия Blumberg с соавторами [65] поверхностного антигена HBV в крови вирусоносителей. Идея того, что на основе поверхностного антигена, полученного от вирусоносителей, может быть создана вакцина, основывалась на факте, что разрешение HBV инфекции сопровождается появлением специфических антител против этого антигена.

Начав практически с нуля, в 1968 году мы начали разрабатывать способы очистки и инактивации поверхностного антигена HBV, выделенного из плазмы доноров-вирусоносителей, который мог бы служить в качестве иммунизирующего антигена при создании вакцины. Путем химической обработки нам удалось добиться [66-68] и необходимой степени очистки, и инактивации в три этапа (обработка пепсином, диссоциация-реассоциация под действием мочевины и обработка формальдегидом). На каждом этапе, как было показано, происходит инактивация [66] большого числа представителей различных семейств вирусов, что служило основанием считать, что последовательное проведение этих процедур приводит к уничтожению всех возможных жизненных форм. К 1970 году была разработана удобная технология и оказалось, что количество антигена, требуемое для иммунизации, достаточно мало [66], таким образом стала очевидна возможность создания вакцины и с экономической точки зрения. Прямые доказательства безопасности и протективной эффективности вакцины были получены в экспериментах на шимпанзе [66].

Первые проверки безопасности экспериментальной вакцины для человека прошли в 1975 году, а в период до 1979 была усовершенствована технология, произведена адсорбция на алюминии, определена и стандартизована соответствующая доза антигена и разработан с участием добровольцев оптимальный режим иммунизации для формирования иммунитета с продолжительной иммунологической памятью. Контролируемые испытания эффективности вакцины были начаты в 1979 году Dr W.Szmuness и сотр. [69] среди молодых мужчин в Нью-Йорке. Был продемонстрирован высокий уровень иммуногенности и протективной эффективности вакцины. Применение плазменной вакцины для широкой иммунизации было разрешено в 1981 году [66]. Это была первая мире лицензированная субъединичная вирусная вакцина, а также первая лицензированная вакцина против вирус-индуцируемого рака у человека.

2. Рекомбинантная дрожжевая вакцина

В 1975 году стало очевидно, что количество плазмы, получаемой от доноров-носителей HBV, не удовлетворяет возросшие потребности производства вакцины (Таблица 12). Успехи молекулярной биологии сделали возможным получение белков на основе рекомбинантных микробных систем. В результате сотрудничества Dr William Rutter (Калифорнийский Университет) и Dr Benjamin Hall (Вашингтонский Университет), используя реагенты, технологии и совместные усилия наших лабораторий, поверхностный антиген гепатита В был “встроен” в геном бактерии, а затем и дрожжевой клетки [70]. Дрожжевая экспрессирующая система работала успешно. Дальнейшие манипуляции позволили получить очищенный дрожжевой антиген, который был совершенно неотличим от плазменного, имел соответствующее качество и удовлетворял экономическим требованиям [71]. Очищенный дрожжевой антиген затем заменил плазменный в вакцине [73], а в 1986 году вакцина была лицензирована. Это произошло через 11 лет после того, как были начаты исследования по созданию соответствующей рекомбинантной системы. “Дрожжевая вакцина” стала первой и пока последней в мире рекомбинантной вакциной.

Таблица 12

Создание вакцины против гепатита В

Вирус гепатита В не размножается в культуре клеток

1965 Открытие Blumberg поверхностного антигена открывает двери на пути к созданию вакцины

1968 В нашей лаборатории начаты исследования по очистке антигена и инактивации всех жизненных форм

1971 Разрабатывается технология, установлена безопасность вакцины in vitro , антиген адсорбируется на алюминии

1973 Безопасность и эффективность вакцины установлена в опытах на шимпанзе

1975 Установлена клиническая безопасность вакцины

1980 Клинические испытания показали высокий уровень протективной эффективности

1981 Лицензирована плазменная вакцина

1975 Начата совместная работа по созданию рекомбинантной дрожжевой системы. Получены успешные результаты.

1980 Разрабатывается технология очистки антигена от дрожжей

1982 Дрожжевой антиген заменил плазменный в вакцине

1986 Лицензирована дрожжевая вакцина

___________________________________________________________

Таблица 13

Характеристика НВ вакцины

 

Образец безопасной и эффективной вакцины

У взрослых протективный титр антител гарантирует » 100% защиту от инфекции

Общая эффективность – 95%

У детей, рожденных HBeAg-позитивными матерями, вакцинация приводит к толерантности и иммунизации по меньшей мере в 75%

У детей серонегативных женщин – защитный титр в » 100%

Стойкий иммунитет с длительной анамнестической памятью

4. Характеристика вакцины

НВ вакцина обладает образцовыми характеристиками, проверенными практикой (Таблица 13) [66, 73-75]. Для взрослых профилактическая эффективность у “ответивших” на вакцинацию составляет по существу 100%, с общей эффективностью – свыше 95%. Особенно важным качеством вакцины является ее способность преодолевать HBeAg-индуцированную толерантность и предупреждать состояние вирусоносительства у новорожденных HВeAg-позитивных женщин и перинатальное инфицирование. Эффективность превышает 75%. У детей, чьи матери не имеют маркеров инфекции, протективная эффективность составляет 100%. Поствакцинальный иммунитет достаточно стойкий и не требует, по мнению ВОЗ, руководящих органов США и большинства других стран, проведения стандартной бустерной ревакцинации (см. [76]). Стойкость иммунитета обусловлена иммунологической памятью, запускающей механизмы защиты, даже тогда, когда количество антител в крови ниже определяемого уровня по истечении значительного периода времени.

5. Стратегии НВ вакцинации

НВ вакцина (Таблица 14) обладает способностью снижать персистенцию инфекции и уровень заболеваемости до пределов, которые ограничиваются только масштабами проводимой иммунизации. Особенно остро эта проблема стоит в странах, где уровень вирусоносительства превышает 2% [77]. По меньшей мере 90 стран проводят политику универсальной иммунизации всех новорожденных [78].

Таблица 14

Проведение НВ иммунизации

 Универсальная вакцинация новорожденных – по меньшей мере в 90 странах

Иммунизация групп повышенного риска и подростков – в некоторых странах

Тотальная иммунизация значительно снизит количество вирусоносителей, число которых на сегодняшний день составляет 350 миллионов, и смертность от заболеваний печени

Иммунизация только новорожденных по всему миру позволит контролировать инфекцию в целом поколении

В результате проведения универсальной программы НВ иммунизации в Тайване частота рака печени у 12-14 летних детей снизилась до 75%.

В некоторых странах иммунизируются лица, относящиеся к группам повышенного риска, или все подростки. Проводимая повсеместно НВ вакцинация позволит значительно снизить число вирусоносителей, которое на сегодняшний день составляет 350 миллионов. Только вакцинация новорожденных позволит контролировать НВ инфекцию в целом поколении. Результатом универсальной вакцинации в Тайване стало снижению до 75% случаев возникновения рака печени среди 12-14-летних детей. Универсальная иммунизация в мировом масштабе приведет к элиминации HBV-инфекции за прогнозируемый промежуток времени.

6. Анализ экономической эффективности вакцинации

Безотносительно социальной пользы, которую приносит вакцинация, решающим обстоятельством в наше время является экономическая эффективность, которая всегда поддается оценке на языке $US (Таблица 15). Профилактика и терапия заболевания конкурируют в отношении источников денежных средств, исходя из стоимости единицы измеренной прибыли. Эта система широко используется для наиболее эффективного планирования затрат.

Таблица 15

Анализ экономической эффективности вакцинации

 Вакцинация приносит огромную социальную пользу, однако политика иммунизации базируется на ее экономической эффективности

Всемирный Банк определяет эффективность с помощью показателей, учитывающих каждый год потери трудоспособности – DALY (Disability Adjusted Life Years)

Шесть вакцин, входящих в РПИ, стоят меньше $25/DALY

Стоимость универсальной иммунизации детей против гепатита В оценивается в $25-50/DALY при использовании покупной вакцины

По оценкам Всемирного Банка:

Цена на вакцину меньше $100 на год DALY является удовлетворительной

Всемирный Банк [80] определяет эффективность с помощью показателей, учитывающих число лет, потерянных (в случае смерти) или неполноценных (в случае инвалидности) в результате заболевания, которое не было предотвращено с помощью вакцинации – DALY (Disability Adjusted Life Years). Согласно оценок Всемирного Банка шесть базовых вакцин Расширенной Программы Иммунизации (РПИ) ВОЗ, стоят меньше $25.00/DALY. Вакцинация против полиомиелита, проводимая отдельно, может стоить дороже, так же как и вакцина против холеры. Цена ротавирусной вакцины должна составлять не больше $10.00 на год DALY, а стоимость теста на ВИЧ варьирует между $1 и 250/DALY. Цена универсальной иммунизации детей против гепатита В составляет $25-50 на год DALY, при использовании приобретенной вакцины. В целом, по оценкам Всемирного Банка, цена вакцины меньше $100 на год DALY считается удовлетворительной [81]. Стоимость программы вакцинации против гепатита В лежит в этих пределах.

  

7. Настоящее и будущее НВ вакцинации

Вакцина против гепатита В стала образцом в отношении безопасности и высокого уровня протективной эффективности (Таблица 16).

[1] MuЁ ller C. The hepatitis alphabet — Hepatitis A-G and TTV. Wien Klin Wochenschr 1999;111:12:461–8.

[6] MacDonald DM, Holmes EC, Lewis JCM, Simmonds P. Detection of hepatitis B virus infection in wild-born chimpanzees (Pantroglodytes 6erus): phylogenetic relationships with human and other primate genotypes. J Virol 2000;74:4253–7.

[25] Blum HE. Hepatitis viruses: genetic variants and clinical signifiсance. Int J Clin Lab Res 1997;27:213–24.

[30] Milich DR, Jones JE, Hughes JL, Price J, Raney AK, McLachlan A. Is a function of the secreted hepatitis B e antigen to induce immunologic tolerance in utero? Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:6599–603.

[32] Wang J-S, Zhu QR. Infection of the fetus with hepatitis B e antigen via the placenta. Lancet 2000;355:989.

[47] Poussin K, Dienes H, Sirma H, Urban S, Beaugrand M, Franco D, Schirmacher P, Breґchot C, Breґchot PP. Expression of mutated hepatitis B virus X genes in Human hepatocellular carcinomas. Int J Cancer 1999;80:497–505.

[50] Kirk GD, Camus-Randon A-M, Mendy M, Goedert JJ, Merle P, Trepo C, Breґchot C, Hainaut P, Montesano R. Ser-249 mutations in plasma DNA of patients with hepatocarcinoma from the Gambia. J Natl Cancer Inst 2000;92:148–53.

[57] Santantonio T, Mazzola M, Iacovazzi T, Miglietta A, Guastadisegni A, Pastore G. Long-term follow-up of patients with anti-HBe:HBV DNA-positive chronic hepatitis B treated for 12 months with lamivudine. J Hepatol 2000;32:300–6.

[61] Carren˜ o V, Zeuzem S, Hopf U, Marcellin P, Graham W, Cooksley E, Fevery J, Diago M, Reddy R, Peters M, Rittweger K, Rokhit A, Pardo M. A phase I:II study of recombinant human interleukin-12 in patients with chronic hepatitis B. J Hepatol 2000;32:317–24.

[83] Nossal GJV. The global alliance for vaccines and immunization. Nat Immunol 2000;1:5–8.